综述：冷冻电子断层扫描图像处理的实用视角：新生物学发现的关键考量

这篇综述深入探讨了冷冻电子断层扫描(cryo-ET)技术在近天然状态下解析生物大分子三维结构的技术流程与最新进展。文章系统梳理了从样品制备(FIB-milling)、数据采集(剂量对称倾斜方案)、预处理(运动校正/CTF矫正)、断层重建(WBP/SIRT算法)到结构解析(STA/SPT)的全链条技术要点，特别强调了机器学习在颗粒识别(template matching)和膜结构分割(segmentation)中的应用突破。作者指出，相比单纯提高分辨率，如何利用分子空间分布(metadata analysis)和形态计量(morphometrics)挖掘生物语境信息，才是cryo-ET最具价值的创新方向。

　　

冷冻电子断层扫描图像处理的技术革新

引言

冷冻电子断层扫描(cryo-ET)作为冷冻电镜(cryo-EM)的重要分支，通过倾斜样品台获取多角度投影图像，重构出保存生物原始状态的三维断层图像。这种技术能有效分离投影中重叠的生物结构，特别适合研究核孔复合体等难以纯化的超大分子复合体。虽然亚断层平均(STA)可获得4.2?分辨率的结构，但受限于电子损伤、样品厚度和分子异质性等因素，其分辨率通常低于单颗粒分析(SPA)。值得注意的是，即使中等分辨率的结构，结合颗粒取向等元数据分析，也能为染色质组装等生物学问题提供全新见解。

样品制备与数据采集

样品制备方面，聚焦离子束(FIB)铣削虽是细胞样品制备的金标准，但存在表面损伤和样品充电等问题。对于特殊生物特征，华夫铣削(waffle milling)或剥离(lift-out)等替代方案可能更优。数据采集参数中，2°倾斜步长适合核小体等小颗粒，而3°步长更适用于核糖体等大复合体。剂量对称倾斜方案虽耗时，但配合多视野同步采集技术可显著提升效率。需注意，总剂量控制在100-140 e/?²范围内，且单帧剂量建议0.5 e/pix/frame以保证运动校正精度。

数据预处理与断层重建

运动校正采用与SPA相同的算法，而曝光滤波能有效抑制高倾角图像的高频噪声。在断层重建环节，加权反投影(WBP)因内存需求低仍是主流，但傅里叶切片定理表明傅里叶反演同样有效。代数重建方法(SIRT/SART)生成的断层图像对比度高但损失分辨率，因此常与直接重建方法配合使用——前者用于视觉分析，后者用于STA。新兴的深度学习算法能补偿缺失楔效应，显著提升断层图像的视觉解析度。

颗粒识别策略

离散颗粒识别中，模板匹配(template matching)通过互相关检测实现分子定位，GPU加速使其计算效率大幅提升。对于膜结合颗粒，PySeg采用离散莫尔斯理论直接追踪膜网络，而Dynamo等工具的GUI界面简化了表面颗粒的几何定义流程。特别值得注意的是，表面关联颗粒的取向存在强空间约束，这种先验知识能显著降低STA的搜索维度。

结构解析方法

STA通过迭代对齐亚断层图像实现结构解析，而单颗粒断层术(SPT)直接处理倾斜系列子图像，计算成本降低但易受投影重叠干扰。当数据集足够大时，STA分辨率主要受限于局部形变引起的对齐误差。此时可利用平均结构作为标记物，反向优化倾斜系列对齐参数，这种"由粗到精"的策略能有效提升最终分辨率。

分割与元数据分析

深度学习驱动的自动分割已能达到人工分割水准，特别是对SARS-CoV-2感染细胞中双膜囊泡(DMVs)等复杂膜系统的识别。将体素数据转化为表面网络后，形态计量可量化膜间距等关键参数，如线粒体外膜(OMM)与内膜(IMM)间距<10nm区域的精确定位。颗粒元数据分析则能揭示分子空间分布规律，如核小体在染色质中的取向偏好，这类信息对理解生物大分子组装机制具有不可替代的价值。

技术展望

当前挑战在于整合日新月异的算法工具，TomoBEAR等流程管理软件正致力于此。随着冷冻电镜直接电子探测器技术的进步，结合人工智能在图像解析中的应用突破，cryo-ET正从单纯的结构测定工具，蜕变为能在分子尺度解读细胞生命活动的全能型技术平台。未来突破点或将集中在原位结构动态追踪与多模态数据整合两个维度。