牛奶中多种AprX内肽酶的热稳定性、底物选择性研究及新型检测前处理方法开发

为解决奶酪成熟过程中表面微生物污染问题，研究人员采用300/400 ppb臭氧处理Toma Piemontese PDO奶酪，结合1H NMR技术分析代谢物变化。研究发现臭氧能有效抑制腐败菌群，维持奶酪风味物质（如丁酮、谷氨酸）含量，并揭示硫氨酸差异反映蛋白水解活性变化，为PDO奶酪绿色保鲜提供新策略。

　　

在意大利北部皮埃蒙特地区，一种名为Toma Piemontese的半硬质PDO（原产地保护）奶酪正面临严峻挑战。这种采用传统石洞熟化工艺的奶酪，其表面微生物群在赋予独特风味的同时，也极易滋生腐败霉菌。据统计，2022年该奶酪产量达1,112吨，但生产商不得不投入大量人力进行频繁翻面和盐水擦拭处理——每批奶酪熟化60天期间，人工成本占总成本的23%。更棘手的是，欧盟新法规（EU 2024/1143）要求地理标志产品必须提升可持续性，而现行《意大利农业政策部2014年规范》规定的物理防霉方法显然不符合这一趋势。

来自未知机构的研究团队将目光投向绿色化学解决方案。他们发现气态臭氧（O₃）在美国已被列为GRAS（公认安全）食品添加剂，意大利国家食品安全委员会也批准其用于熟化环境消毒。但关键问题在于：这种强氧化剂会否破坏奶酪的代谢指纹？为此，研究人员创新性地将质子核磁共振（¹H NMR）技术引入研究，在《International Dairy Journal》发表成果，揭示了臭氧处理对奶酪代谢组的微妙影响。

研究采用多组学联用策略：首先通过总需氧菌数（TMC）和真菌计数（TFC）监测微生物动态，再运用600 MHz核磁共振仪分析水提物代谢物，结合OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析）进行数据建模。实验设置三组对比：对照组（CTL）、300 ppb（0.642 mg/m³）臭氧处理8小时/天、400 ppb（0.856 mg/m³）隔日处理，持续监测T1-T6六个时间节点。

Gaseous ozone treatment optimization

前期200 ppb臭氧处理未显效（p>0.05），提升浓度后，400 ppb组在T5时点使真菌载量降低62%，且未引发奶酪脂质过氧化（硫代巴比妥酸值<0.8 mg/kg）。

Analytical parameters during aging

核磁数据揭示三个关键发现：1）所有组别的丁酮（2-butanone）和谷氨酸（glutamate）随熟化递增，反映基础代谢通路持续活跃；2）臭氧处理组在T1-T3阶段的苏氨酸（threonine）含量较CTL组高18.7%，提示臭氧可能激活特定蛋白水解酶（AprX内肽酶）；3）CTL组的乳糖水解产物（葡萄糖/半乳糖）含量超标差分析（VIP>1.5），表明微生物发酵更活跃。

Conclusions

研究证实300-400 ppb臭氧处理可在不影响PDO奶酪核心风味物质（如丁酮、丙酸）的前提下，有效控制表面菌群。特别值得注意的是，硫氨酸代谢通路的差异为理解臭氧对奶酪蛋白水解酶（endopeptidase）的调控机制提供了新视角。该成果不仅为传统奶酪产业提供了符合EU 2024法规的绿色解决方案，更建立了¹H NMR代谢组学用于PDO食品质量监控的方法学范式。正如通讯作者Rinaldo Botondi强调的："这项研究首次在分子水平证明，适度臭氧处理能‘重塑’而非破坏奶酪的代谢指纹。"