NRBP1假激酶通过渗透应激激活WNK信号通路的分子机制研究

研究人员针对WNK激酶家族在渗透应激响应中的调控机制这一关键科学问题，通过邻近标记技术发现NRBP1假激酶与TSC22D2/4适配蛋白能特异性结合并激活WNK1通路。研究证实NRBP1通过其C端保守CCT结构域直接诱导WNK4活化，并构建了WNK1-SPAK-NRBP1-TSC22D4复合体的AlphaFold-3预测模型，揭示了该通路在离子稳态和血压调控中的新型上游激活机制，为高血压等疾病治疗提供新靶点。

　　

细胞如何感知环境变化并作出精确响应，一直是生命科学的核心问题。在渗透压调控领域，WNK（With-No-Lysine）激酶家族作为关键的"细胞渗透压传感器"，通过调控SPAK/OXSR1激酶和离子共转运蛋白维持细胞内环境稳定。然而，WNK通路的上游激活机制仍存在重大知识空白——尤其是在渗透应激条件下，哪些分子直接触发WNK的自动磷酸化？这个问题的解答不仅关乎基础生物学认知，更对理解高血压等疾病的发病机制具有重要意义。

来自MRC蛋白磷酸化与泛素化单位的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究，通过创新性地结合TurboID邻近标记技术和AlphaFold-3人工智能预测，发现NRBP1（Nuclear Receptor Binding Protein 1）假激酶是WNK通路的关键上游调控因子。这项研究揭示了渗透应激条件下，NRBP1通过其类CCT结构域与WNK1形成复合体，直接促进WNK激酶活化的分子机制，为理解细胞应激响应提供了全新视角。

研究主要运用了四项关键技术：1）基于CRISPR的GFP-WNK1基因敲入细胞系构建；2）TurboID邻近标记结合质谱技术鉴定渗透应激依赖的蛋白互作网络；3）诱导型蛋白降解系统（BromoTag-AGB1）实现NRBP1的快速敲降；4）AlphaFold-3预测蛋白质复合体三维结构并辅以点突变验证。

主要研究结果

渗透应激诱导WNK1与NRBP1假激酶相互作用

通过TurboID-MS系统比较正常与高渗条件下WNK1相互作用组，发现NRBP1及其结合蛋白TSC22D2/4在0.5M山梨醇刺激后特异性富集（分别增加9.7倍和6.9倍）。免疫共沉淀证实这种相互作用具有渗透压依赖性，且伴随SPAK Ser³⁷¹和OXSR1 Thr¹⁸⁵位点的磷酸化增强。

NRBP1与TSC22D2/4的分子特征

序列分析显示NRBP1假激酶域与WNK激酶高度同源，其C端含有类似WNK的CCT结构域。AF3预测显示TSC22D2/4通过N端两个RΦ-motif（RFRV和RWTC）分别结合WNK1的CCTL1域和NRBP1的CCT域，形成稳定的异源四聚体结构。点突变实验证实TSC22D4的RWTC基序突变可使NRBP1结合能力丧失80%。

WNK1磷酸化NRBP1 Thr²³²位点

体外激酶实验显示重组WNK1可使NRBP1 Thr²³²发生磷酸化，质谱鉴定和特异性抗体验证该位点位于假激酶域的T-loop区域。细胞实验中，山梨醇刺激1分钟内即可检测到NRBP1 Thr²³²磷酸化，该过程可被WNK抑制剂WNK-463阻断。

NRBP1调控WNK通路活性

使用BromoTag-AGB1系统快速降解NRBP1后，基础状态和山梨醇诱导的SPAK/OXSR1磷酸化均显著降低。NRBP1敲除细胞中，WNK1自身磷酸化位点Ser³⁸²的活化也受到抑制。值得注意的是，回补NRBP1 Thr²³²A突变体仍能恢复通路活性，表明该位点磷酸化并非激活必需。

NRBP1直接激活WNK4

在无细胞体系中，重组NRBP1可显著促进昆虫细胞表达的WNK4（1-449）在Ser³³⁵位点的自磷酸化，并增强其对底物OXSR1 Thr¹⁸⁵的磷酸化能力。同源蛋白NRBP2也表现出相似的WNK4激活能力。

复合体结构的AF3预测

AF3构建的WNK1-SPAK-NRBP1-TSC22D4复合体模型显示：1）TSC22D4二聚体通过RΦ-motif-A/B桥接WNK1 CCTL1和NRBP1 CCT域；2）WNK1的RΦ-motif-2（RFIV）结合SPAK的CCT域；3）ATP的γ-磷酸基团正对SPAK三个已知磷酸化位点（Thr²³¹/Ser³⁷¹/Ser³⁸⁵），与实验数据高度吻合。

这项研究系统阐明了NRBP1-TSC22D复合物作为WNK通路新型激活机制的核心作用。在生物学意义上，该发现填补了"渗透应激信号如何转化为WNK激酶活化"这一关键环节的空白；在医学价值方面，NRBP1-WNK调控轴的发现为开发针对高血压、神经发育障碍等疾病的新疗法提供了潜在靶点。特别值得注意的是，NRBP1作为缺乏催化活性的假激酶，却能通过变构调节激活WNK家族激酶，这一发现拓展了人们对伪激酶生物学功能的认识。研究还提出若干待解问题：渗透应激如何触发NRBP1-WNK复合体形成？NRBP1是否参与WNK对氯离子浓度的感知？这些问题的解答将进一步深化对细胞应激响应机制的理解。

论文通过多学科交叉方法，从发现相互作用、解析分子机制到预测结构模型，为细胞信号转导研究提供了范式。正如作者指出，NRBP1可能像STRADα激活LKB1那样，代表了一类新型的"假激酶-激酶"调控模块，这一发现将为后续研究开辟新方向。