酿酒酵母代谢工程实现羟基酪醇和红景天苷的从头生物合成：突破天然提取与化学合成瓶颈

本研究通过代谢工程改造酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），构建高效从头合成羟基酪醇（hydroxytyrosol）和红景天苷（salidroside）的微生物平台。通过优化酪醇合成途径、引入异源羟化酶（PaHpaB/EcHpaC）和糖基转移酶（RrU8GT33），并强化UDP-葡萄糖（UDP-Glc）供给，最终在15 L生物反应器中分别实现677.6 mg/L和18.9 g/L的产量，为工业化生产提供绿色解决方案。

　　

研究背景

羟基酪醇（3,4-dihydroxyphenylethanol）和红景天苷是具有强抗氧化、抗炎和神经保护作用的天然苯乙醇类化合物，广泛应用于医药、化妆品和保健品领域。传统植物提取法受限于低产率，而化学合成存在步骤复杂、环境污染等问题。本研究以模式微生物酿酒酵母为底盘细胞，通过系统代谢工程改造，实现从葡萄糖等简单碳源高效合成这两种高价值化合物。

材料与方法

菌株构建：以CEN.PK2-1C为出发菌株，采用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑。关键操作包括：

1. 酪醇合成途径优化：过表达磷酸酮醇酶基因（Bbxfpk）、转酮酶（TKL1）和核糖-5-磷酸异构酶（RKI1），删除丙酮酸脱羧酶基因（PDC1）；引入反馈抑制解除突变体ARO4^K229L和ARO7^G141S。

2. 羟基酪醇合成：整合来自铜绿假单胞菌的羟化酶（PaHpaB）和大肠杆菌的还原酶（EcHpaC）。

3. 红景天苷合成：引入红景天来源的糖基转移酶RrU8GT33，并截短甘草蔗糖合成酶（tGuSUS1）以增强UDP-Glc供给。

发酵工艺：采用摇瓶和15 L生物反应器进行分批补料发酵，通过HPLC检测产物浓度。

结果与突破

酪醇高产菌株构建

基础菌株ZYT1通过强化莽草酸途径和Ehrlich途径，酪醇产量达571.8 mg/L，较野生型提高12.5倍。关键策略包括：

• 过表达Bbxfpk将碳流导向磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）

• 删除TRP2和PHA2减少分支代谢分流

• 引入大肠杆菌双功能酶TyrA^M53I/A354V

羟基酪醇生物合成

工程菌ZYHT1在摇瓶中产量达304.4 mg/L。补料发酵时，通过修复营养缺陷型标记（亮氨酸、色氨酸等），产量提升至677.6 mg/L，但细胞生长（OD₆₀₀=33）受羟基酪醇抗菌活性抑制。

红景天苷产量突破

初始菌株ZYSAL1产量仅48.4 mg/L。通过以下优化实现18.9 g/L的工业化水平产量：

1. 增加RrU8GT33拷贝数使产量达705.6 mg/L

2. 引入截短蔗糖合成酶tGuSUS1，摇瓶产量提升至1,021.0 mg/L

3. 15 L发酵中，通过动态调控糖供给，最终产量达18.9 g/L，为目前酵母体系的最高报道之一

技术亮点与局限

创新点：

• 首创将植物蔗糖代谢系统（tGuSUS1）与酵母糖基化途径耦合

• 羟化酶PaHpaB/EcHpaC的NADPH依赖性问题通过辅因子工程部分缓解

现存挑战：

1. 羟基酪醇毒性导致菌体生长受限

2. 蔗糖转运蛋白SlSUT4表达反而降低产量，可能与酵母膜转运效率低有关

3. 大规模发酵时，红景天苷合成后期出现副产物积累

应用前景

该研究建立的微生物合成平台具有显著优势：

• 经济性：红景天苷生产成本较植物提取降低约60%

• 可持续性：避免橄榄和红景天植物的过度开采

• 扩展性：该策略可推广至其他苯乙醇类化合物（如松柏苷）的生产

未来可通过动态调控（如葡萄糖响应型启动子）和细胞器区室化（如靶向线粒体的途径工程）进一步优化产量。研究为天然产物的微生物制造提供了范式转移级解决方案。