基于人腺病毒5载体与旋毛虫胱抑素样蛋白的异源初免-加强免疫策略在小鼠中激发保护性黏膜免疫

这篇研究创新性地采用人腺病毒5载体(rAd5)递送旋毛虫(T. spiralis)胱抑素样蛋白(TsCLP)，结合重组蛋白(rTsCLP)的异源初免-加强策略，通过鼻内-肌肉注射双途径激活黏膜与系统免疫。实验证明该方案能显著提升分泌型IgA(sIgA)、组胺水平和杯状细胞数量，诱导Th1/Th2混合应答(IFN-γ/IL-4协同作用)，使成虫和肌幼虫负荷分别降低61.17%和58.22%，为抗蠕虫疫苗开发提供了新思路。

　　

生物信息学分析与TsCLP基因沉默

通过Expasy和SignalP 5.0分析显示，旋毛虫胱抑素样蛋白(TsCLP)基因全长1218bp，编码45.9kDa的酸性蛋白(pI=5.43)，具有18个氨基酸的信号肽。PyMOL三维结构预测显示其含有B细胞、CTL和BTL表位。采用电穿孔法将siRNA-834导入肌幼虫(ML)后，qPCR和Western blot证实TsCLP mRNA及蛋白表达显著降低，感染小鼠的成虫(Ad3)回收量减少，证实该蛋白在寄生虫入侵中起关键作用。

重组腺病毒rAd5TsCLP的构建与鉴定

基于pAdEasy-1系统构建的E1/E3缺失型Ad5载体成功整合密码子优化的TsCLP基因。透射电镜显示重组病毒颗粒保持典型二十面体结构，免疫荧光检测到感染HEK293A细胞中红色荧光标记的TsCLP表达。生长曲线证实插入基因不影响病毒复制能力(MOI=0.1时TCID₅₀与空载体Ad5Neg无差异)，Western blot在感染细胞裂解物中检测到45.9kDa目标条带。

异源免疫激发的血清学反应

BALB/c小鼠鼻内初免rAd5TsCLP(10⁸ PFU)后肌肉加强rTsCLP(60μg)，ELISA显示：

1. 特异性IgG滴度在加强后提升10倍，IgG1>IgG2a提示Th2优势

2. IgM在初免1周即显著升高(*P<0.05)，5周达峰值，反映早期防御激活

3. 中和抗体(NAb)滴度3周达峰，维持至9周仍高于其他组

   对比同源rTsCLP:rTsCLP组，异源策略诱导更快、更强的抗体反应，可能与腺病毒激活TLR信号通路有关。

肠道黏膜免疫增强机制

AB-PAS染色显示rAd5TsCLP:rTsCLP组小肠杯状细胞密度增加3倍(**P<0.01)，伴随酸性黏蛋白(蓝色)大量分泌。肠道灌洗液检测发现：

• 总sIgA和TsCLP特异性sIgA水平较对照组提升5-8倍

• 组胺浓度在免疫后短暂飙升，与肥大细胞募集相关

  这种"双引擎"机制——sIgA阻断幼虫黏附+组胺促进黏液屏障形成，协同抑制寄生虫定植。

细胞免疫应答特征

流式细胞术显示异源组脾脏CD3⁺CD4⁺(45.7%)和CD3⁺CD8⁺(28.3%)T细胞比例显著增高(*P<0.001)。Luminex多因子检测揭示：

1. 血清中Th1细胞因子(IFN-γ、TNF-α)与Th2因子(IL-4、IL-13)同步升高

2. 脾细胞培养上清中IL-13达1200pg/mL，促进IgE介导的ADCC效应

3. 颈淋巴结中IL-1β和TGF-β平衡炎症反应

   这种Th1/Th2混合应答模拟天然抗寄生虫免疫，优于单一极化策略。

免疫保护效果评估

攻毒实验(250条肌幼虫)显示：

• 成虫负荷减少61.17%(vs PBS组)，肌幼虫减少58.22%

• 膈肌HE染色显示异源组炎症细胞浸润最显著，幼虫囊包结构破坏

• 体重监测未发现不良反应，证实方案安全性

  保护机制可归纳为：腺病毒载体促进抗原提呈→CD4⁺T细胞活化→B细胞分泌sIgA/IgG1→协同杯状细胞黏液屏障→阻断幼虫肠道入侵和肌肉移行。

讨论与展望

该研究突破传统疫苗难以激活黏膜免疫的瓶颈，创新性结合腺病毒载体与重组蛋白优势：

1. rAd5载体通过TLR9/MyD88通路增强APC功能

2. CpG 1018佐剂促进Th1偏向应答

3. TsCLP的酪糖结构诱导中和抗体

   未来需在猪模型验证效果，并探索多抗原组合策略。该平台技术对弓形虫、血吸虫等胞内寄生虫疫苗研发具有借鉴意义。