福尔马林固定与冷冻十二指肠活检中上皮内淋巴细胞的免疫组化检测：结果可比性与临界值修订

本研究针对乳糜泻(CD)诊断中TcRγδ+和CD3+上皮内淋巴细胞(IELs)计数的临床需求，开发了适用于福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的免疫组化(IHC)检测方案。研究团队通过比较FFPE与冷冻OCT包埋样本的检测结果，确立了TcRγδ+(4个/mm)和CD3+(40个/mm)的新型诊断临界值，证实两种方法具有高度相关性(r=0.7)。该突破性进展解决了临床机构常规不保存冷冻样本的难题，为疑难CD病例的诊断提供了更便捷精准的病理学工具。

　　

在消化系统疾病诊断领域，乳糜泻(Celiac Disease, CD)的诊断始终存在一个"灰色地带"——当患者十二指肠黏膜结构正常或仅有轻度异常时，如何准确识别潜在的乳糜泻患者？这个难题的核心在于上皮内淋巴细胞(Intraepithelial Lymphocytes, IELs)的评估。虽然TcRγδ⁺IELs被认为是CD的特异性标志物，但传统检测必须使用冷冻保存的OCT包埋样本，而这类样本在大多数医院并不常规保存，这成为临床诊断的重要瓶颈。

来自那不勒斯腓特烈二世大学转化医学科学系儿科部门的研究团队在《Digestive Diseases and Sciences》发表的研究，为解决这一临床困境带来了突破。研究人员开发出适用于常规福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)样本的免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)检测方案，通过对100例患者(40例活动性CD，60例非CD对照)的配对样本分析，不仅验证了新方法的可靠性，更重新定义了关键诊断阈值。

研究采用回顾性队列设计，纳入2019-2023年间2-18岁的患者样本。关键技术包括：优化FFPE样本的抗原修复条件(100°C pH9缓冲液处理30分钟)；使用TcRγδ H41单克隆抗体(1:100)和CD3抗体(1:100)进行双重标记；建立标准化的显微镜计数方法(40倍物镜配合标尺目镜，每样本至少评估5mm上皮长度)。所有计数均以阳性细胞数/mm上皮表示，确保不同黏膜形态的可比性。

【FFPE样本的免疫组化分析】

研究首次证实FFPE样本可清晰显示TcRγδ⁺IELs，背景染色低且与冷冻样本视觉效果相当。定量分析显示活动性CD患者的TcRγδ⁺IELs密度(20.6±12.7个/mm)显著高于对照组(1.9±1.7个/mm)，CD3⁺IELs也呈现相似差异(60.3±29.3 vs 23.9±14.8个/mm)。值得注意的是，TcRγδ⁺细胞占IELs总数的比例在CD组达40%，而对照组仅10%。

【诊断临界值的确定】

通过受试者工作特征(ROC)曲线分析，研究确立FFPE样本的诊断临界值：TcRγδ⁺≥4个/mm(敏感性95%，特异性88%)，CD3⁺≥40个/mm(敏感性85%，特异性92%)。这些数值与对照组95百分位数完全吻合，具有坚实的统计学基础。

【冷冻与FFPE样本的相关性】

对传统冷冻OCT样本的重新评估获得相似临界值(TcRγδ⁺≥4个/mm，CD3⁺≥34个/mm)。Pearson相关性分析显示两种包埋方法的TcRγδ⁺(r=0.7)和CD3⁺(r=0.7)计数结果高度一致，证实FFPE方法可完全替代冷冻样本检测。

这项研究的意义不仅在于技术突破，更在于其临床转化价值。Mariantonia Maglio等研究者建立的FFPE-IHC方案，使TcRγδ⁺IELs检测能够常规应用于任何病理实验室，无需特殊样本保存条件。新确立的诊断临界值特别有助于鉴别组织学表现不典型的CD病例，如潜在CD(Marsh 0-1级)和难治性CD的诊断评估。研究还揭示TcRγδ⁺/CD3⁺比值在CD组(38.6±32.7%)显著高于对照组(10.2±9.3%)，这一指标可能成为未来CD免疫监测的新参数。

该成果为落实ESPGHAN(欧洲儿科胃肠病学、肝病学和营养学会)2020指南中关于IELs评估的建议提供了切实可行的解决方案，将显著提高CD诊断的准确性和可及性。研究者特别指出，相比流式细胞术等复杂技术，这种基于常规病理样本的方法更易于临床推广，尤其适合资源有限的医疗机构。随着该方案的广泛应用，关于CD边界病例的诊断标准有望达成更广泛的国际共识。