花生Ubiquitin4启动子驱动稳定基因过表达及高效多重CRISPR/Cas9基因编辑

为解决花生遗传转化中稳定基因表达工具缺乏的问题，北京大学现代农业研究院的研究团队鉴定并克隆了花生内源高表达Ubiquitin（UBQ）启动子AhUBQ4，通过瞬时和稳定表达实验证明其驱动GUS和Ruby报告基因的效率显著高于传统35S启动子，并成功将其应用于CRISPR/Cas9系统实现花生HY5-HOMOLOG基因高效编辑。该研究为花生功能基因组学和分子育种提供了重要工具。

　　

花生作为全球重要的油料作物，其遗传改良长期受限于转化效率低和转基因沉默等问题。传统使用的病毒源35S启动子存在表达不稳定、组织特异性差等缺陷，而内源启动子如Ubiquitin（UBQ）家族虽在其他作物中表现优异，但花生中尚未有系统性研究。北京大学现代农业研究院（山东潍坊）的研究团队通过基因组和转录组分析，从花生中筛选出高表达UBQ基因arahy.E356RC（AhUBQ4），并对其启动子功能进行深入解析。

研究团队首先通过生物信息学分析，从四倍体花生基因组中鉴定出18个UBQ基因，其中AhUBQ4在15种组织中的平均表达量（FPKM值2170）远超其他成员。克隆其973-bp启动子片段后，通过农杆菌介导的瞬时转化实验证明，AhUBQ4pro在烟草叶片和花生茎段中驱动GUS表达的强度显著高于35S启动子，且表达更均匀。稳定转化实验中，AhUBQ4pro在拟南芥幼苗和花生毛状根中分别驱动GUS和Ruby报告基因的表达量较35Spro提升2-3倍，尤其在根部表现出显著优势。

关键技术包括：（1）基于花生公共转录组数据库筛选高表达UBQ基因；（2）构建AhUBQ4pro驱动的GUS/Ruby报告系统；（3）开发AhUBQ4pro-CRISPR/Cas9载体，通过毛状根转化系统验证编辑效率。

主要研究结果

1. AhUBQ4启动子的鉴定与表达特征

   通过比对拟南芥UBQ基因，在花生基因组中发现AhUBQ4在花和发育早期种子中表达量超3000 FPKM，成熟种子中仍保持400 FPKM以上，呈现组成型高表达模式。

2. 瞬时表达验证启动子活性

   在烟草叶片中，AhUBQ4pro驱动的GUS表达量较35Spro提高50%；花生茎段中两者活性相当，但AhUBQ4pro染色更均匀，避免了35Spro常见的斑块状表达。

3. 稳定转化系统的性能比较

   拟南芥转基因株系显示，AhUBQ4pro在根部的GUS表达量是35Spro的3倍；花生毛状根中Ruby色素积累更显著，qPCR证实转录水平提升2.1倍。

4. CRISPR/Cas9编辑效率提升

   将AhUBQ4pro应用于靶向HYH基因的编辑系统后，毛状根平均编辑事件达7.3次/株（35Spro为5次），且引入更多碱基替换突变，编辑类型更丰富。GFP荧光检测显示AhUBQ4pro驱动的Cas9表达强度提高30%。

该研究首次证明花生内源AhUBQ4启动子在驱动外源基因表达和基因组编辑中的优越性，其克服了病毒启动子的表观沉默风险，为花生功能研究和分子设计育种提供了新工具。研究者特别指出，AhUBQ4pro的小片段（973-bp）特性更易嵌入载体，在多重编辑体系中具有独特优势。论文发表于《aBIOTECH》，为作物遗传改良领域提供了可推广的启动子优化策略。