hInGeTox平台：基于人源iPSC的慢病毒载体基因毒性评估新策略

本研究针对慢病毒(LV)载体基因治疗中潜在的基因毒性风险，开发了首个基于人诱导多能干细胞(iPSC)及其肝样细胞(HLC)衍生物的体外评估平台hInGeTox。通过比较含天然LTR与自失活(SIN)LTR的两种LV载体，发现两者均可通过整合位点选择、融合转录本形成及表观遗传修饰等机制激活致癌基因。研究首次揭示SIN载体通过DNA损伤响应通路发挥保护作用，而LTR载体则表现出更强的甲基化相关致癌倾向，为优化载体设计提供了重要安全评估工具。

　　

基因治疗领域近年来取得突破性进展，但慢病毒(LV)载体整合宿主基因组引发的基因毒性风险始终是悬在研究者头上的"达摩克利斯之剑"。传统小鼠模型存在过度敏感、种属差异等局限，临床案例中HMGA2基因激活导致的β-地中海贫血患者克隆增殖，以及CAR-T治疗中TET2基因失活引发的T细胞恶性肿瘤，都在警示着建立人源化评估体系的紧迫性。

英国伦敦大学学院的研究团队在《Gene Therapy》发表的研究中，创新性地构建了hInGeTox平台。该研究采用两种仅LTR构型差异的LV载体(pHV含天然LTR，pHR为SIN构型)，通过多组学分析揭示了载体-宿主互作机制：全基因组整合位点(IS)分析显示两种载体均偏好肿瘤 suppressor基因；RNA测序发现LTR载体诱导甲基化相关基因表达，而SIN载体激活DNA损伤响应通路；甲基化芯片检测到pHV感染的iPSC存在210个启动子区超甲基化基因。这些发现为LV载体安全性优化提供了分子靶点。

关键技术包括：1)建立3D肝样细胞(HLC)培养体系；2)EPTS/LM-PCR技术进行高通量整合位点分析；3)RNA测序检测载体-宿主融合转录本；4)Illumina甲基化芯片分析表观遗传修饰；5)WGCNA网络分析基因共表达模块。

iPSC及其3D HLC衍生物高度易感LV转导

研究证实iPSC(90%转导率)和HLC(85%)均适合作为评估模型，pHV在HLC中呈现更高载体拷贝数(VCN)。

LV插入位点分析

分析412,786个IS发现：1)两种载体均富集于E2F靶基因等肿瘤相关通路；2)30天后IS数量减少提示克隆选择；3)LTR载体在PI3K-AKT/mTOR通路基因中持续存在。

克隆追踪揭示致癌基因富集

差异分析鉴定出23个致癌基因和35个肿瘤抑制基因的IS变化，如SET、BRAF等已知风险基因。

感染细胞的差异基因表达

pHV激活WNT信号通路(n=12)和甲基化基因(n=11)，而pHR上调DNA损伤响应基因(n=21)。HLC中pHV引起7倍更多DEG，涉及NF-κB等致癌通路。

基因共表达网络分析

WGCNA鉴定出9个功能模块，LTR载体显著关联蛋白修饰(含NSUN7等甲基转移酶)和细胞代谢模块。

载体-基因组融合转录本

发现69个融合转录本，其中38个同时存在IS和DEG，SIN载体更多通过免疫相关基因融合发挥作用。

癌症特征谱比对

转录组特征评分显示：早期pHR评分更高，但30天后pHV反超，提示LTR载体长期风险。

表观遗传学分析

pHV引起210个启动子区超甲基化，显著多于pHR(24个)，涉及神经递质调控等癌症相关通路。

这项研究开创性地建立了人源化基因毒性评估体系，揭示LTR构型通过甲基化修饰驱动致癌倾向的分子机制。发现载体设计不仅影响直接基因激活，还会通过表观遗传重编程间接调控致癌通路。hInGeTox平台的多模块分析策略，为基因治疗产品的临床前安全评估提供了新范式，其发现将指导更安全的载体设计——如优化CpG含量、消除隐蔽剪接位点等。该研究同时证实，即使SIN载体仍存在通过融合转录本导致基因失调的风险，这为监管机构完善基因治疗产品审批标准提供了重要科学依据。