外泌体miRNA-29b通过PDGF甲基化调控促进胆道闭锁肝纤维化的机制研究

本研究针对胆道闭锁(BA)患儿肝纤维化机制不明的临床难题，通过发现外周血外泌体中高表达的miRNA-29b可靶向抑制DNMT3a/3b表达，导致PDGFA启动子区低甲基化，进而激活肝星状细胞(LX-2)促进胶原沉积。研究首次揭示了外泌体miRNA-29b通过表观遗传调控参与BA肝纤维化的分子机制，为开发新型诊疗标志物提供了理论依据。

　　

胆道闭锁(BA)是威胁婴幼儿生命的严重肝胆疾病，其特征性肝内外胆管闭锁导致胆汁淤积和进行性肝纤维化。尽管Kasai手术可暂时缓解症状，但70-80%患儿最终仍需肝移植，这主要归因于术后持续的肝纤维化进展。目前BA肝纤维化的分子机制尚未阐明，特别是外泌体介导的细胞间通讯如何参与这一过程仍属空白领域。

遵义医科大学附属医院儿科外科的研究团队在《European Journal of Medical Research》发表的研究中，发现BA患儿外周血外泌体中miRNA-29b异常高表达，而肝组织中血小板衍生生长因子(PDGF)显著上调。通过构建miRNA-29b过表达/抑制的Jurkat细胞模型提取外泌体，与肝星状细胞(LX-2)共培养，结合DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-Azac)处理，揭示了miRNA-29b通过靶向抑制DNMT3a/3b导致PDGFA启动子低甲基化，进而激活肝星状细胞的分子机制。

研究采用的主要技术包括：从15例BA和15例胆总管囊肿(CC)患儿获取外周血外泌体和肝组织样本；透射电镜和纳米流式检测外泌体特征；慢病毒转染构建miRNA-29b修饰的Jurkat细胞系；双荧光素酶报告基因验证miRNA-29b与DNMT3a/3b的靶向关系；亚硫酸盐测序分析PDGFA启动子甲基化状态；CCK-8检测肝星状细胞增殖活性。

研究结果部分：

"Identification of miR-29b overexpression and elevated PDGFA in children with biliary atresia"：透射电镜证实BA患儿外泌体呈典型盘状结构，miRNA-29b表达较CC组高4.2倍(P<0.01)，PDGFA在肝组织的mRNA和蛋白水平分别升高3.8倍和2.6倍。全基因组甲基化分析显示BA肝组织LINE-1、ALU和SAT2序列均显著低甲基化(P<0.05)。

"Construction of stable transmissible strains and verification of exosomes"：成功构建miRNA-29b过表达/抑制的Jurkat细胞系(转染效率>85%)，纳米颗粒追踪显示外泌体平均粒径88.35nm，浓度0.89×10¹⁰ particles/mL。外泌体标志物CD9/CD63阳性率10.6%/9.1%，证实外泌体特征完整。

"Effects of miRNA-29b overexpression and inhibition in exosomes"：miRNA-29b过表达外泌体使LX-2细胞DNMT3a/3b表达降低60%-70%(P<0.01)，PDGFA表达升高3.1倍，胶原蛋白COL1A1和α-SMA分别增加2.8倍和3.4倍。双荧光素酶实验证实DNMT3a/3b是miRNA-29b直接靶点。

"Regulation of PDGFA DNA promoter methylation"：miRNA-29b过表达外泌体使PDGFA启动子CpG岛甲基化水平降低42%(P<0.01)，LX-2细胞增殖活性提高2.3倍。5-Azac处理可协同增强这种效应，使甲基化水平进一步降低至对照组的30%。

研究结论创新性地提出了"外泌体miRNA-29b-DNMT3a/3b-PDGFA"调控轴在BA肝纤维化中的作用机制：循环外泌体携带的miRNA-29b通过抑制DNMT3a/3b表达，导致PDGFA启动子低甲基化而异常激活，进而刺激肝星状细胞增殖和胶原分泌。这一发现不仅解释了BA患儿术后持续肝纤维化的分子基础，还为开发基于外泌体miRNA的早期诊断标志物和靶向治疗策略提供了新思路。研究首次将外泌体介导的表观遗传调控与BA病理进程相联系，为理解儿童肝纤维化机制开辟了新视角。