铜螯合超支化聚乙烯亚胺复合物对休眠态曲霉孢子和萌发菌丝的协同抗真菌机制研究

本研究针对当前抗真菌药物机制单一且难以靶向休眠真菌细胞的临床难题，创新性地构建了铜离子螯合超支化聚乙烯亚胺（PEI-Cu）复合物。希腊国家科学研究中心"Demokritos"团队通过系列实验证实，PEI-Cu1/4和PEI-Cu1/16能有效抑制模式菌株构巢曲霉（Aspergillus nidulans）休眠分生孢子的存活，并干扰菌丝生长速率、氧化还原状态及线粒体网络形态。该研究为开发靶向耐药性休眠真菌的新型抗真菌剂提供了重要理论依据。

　　

真菌感染已成为全球公共卫生的重大威胁，尤其对免疫功能低下人群具有致命风险。然而现有抗真菌药物面临双重困境：一方面作用机制单一导致耐药性快速产生，另一方面难以杀灭处于休眠状态的"顽固者"（persisters）真菌细胞。更棘手的是，人类与真菌细胞共享诸多生物通路，使得药物开发如同"在雷区中寻找安全路径"。面对这一挑战，希腊国家科学研究中心"Demokritos"（National Centre for Scientific Research "Demokritos"）的科研团队将目光投向了一种特殊材料——铜离子螯合超支化聚乙烯亚胺（PEI-Cu），以机会性病原体构巢曲霉（Aspergillus nidulans）为模型，探索其对抗休眠真菌的创新解决方案。这项突破性研究发表在《Scientific Reports》期刊，为抗真菌药物研发开辟了新思路。

研究团队采用多学科交叉技术手段：通过动态光散射（DLS）和ζ电位分析表征PEI-Cu复合物物理特性；利用紫外可见光谱验证铜离子螯合效率；采用最小抑菌浓度（MIC）测定评估抗真菌活性；结合共聚焦显微镜（CLM）实时监测菌丝生长动态；通过线粒体特异性荧光探针（MitoView 650）观察细胞器形态变化；并采用MTT法检测对人皮肤成纤维细胞的毒性。

PEI-Cu复合物的构建与表征
研究人员精确调控铜离子与PEI伯氨基团摩尔比（Cu:N=1:4至1:32），证实1:4比例可实现铜离子完全螯合。紫外光谱632 nm特征峰显示铜与PEI中伯/仲/叔氮原子形成平面四配位结构（如图1所示）。动态光散射显示复合物粒径随铜含量增加呈非单调变化，1:16比例时达到峰值。

抗休眠孢子活性
在关键突破中，5 μg/mL PEI-Cu_1/4使休眠孢子存活率降至27%，优于单纯PEI（36%）。延长处理时间至6小时或提高浓度至50 μg/mL时，孢子存活率进一步降至12%。相衬显微镜显示（图2），处理组孢子停滞在极性建立阶段，无法形成正常菌丝。

人源细胞安全性
MTT实验显示（图3），10 μg/mL PEI-Cu复合物处理12小时后，正常人皮肤成纤维细胞仍保持90%以上活力。值得注意的是，PEI-Cu的细胞毒性显著低于母体PEI，而对应浓度的CuCl₂完全无毒性，提示铜的螯合可降低PEI的毒副作用。

作用机制解析
时间分辨共聚焦显微镜（图6）揭示铜延缓了PEI内化过程：PEI-Cu_1/4需90分钟完全抑制菌丝生长，而PEI仅需20分钟。但一旦进入细胞，所有化合物均在10分钟内起效。活性氧（ROS）检测（图7）显示PEI-Cu_1/4诱导的氧化应激弱于PEI，暗示细胞内铜可能通过抗氧化途径产生保护作用。线粒体形态分析（图8）显示处理5分钟后即出现显著片段化，这种早于生长抑制的现象提示线粒体功能障碍可能是关键作用靶点。

铜离子释放特性
通过构巢曲霉孢子色素合成功能实验（图4），证实PEI-Cu能在缺铜培养基中释放生物可利用铜离子，恢复铜依赖性漆酶（laccase）活性，使孢子由黄色恢复正常暗绿色。

这项研究揭示了PEI-Cu复合物的双重优势：PEI发挥主要杀菌作用，而铜离子不仅增强对休眠孢子的杀伤力，还通过调控内化过程降低对哺乳动物细胞的毒性。特别值得注意的是，铜螯合使材料获得"智能"特性——在真菌细胞内可控释放活性成分，这种"特洛伊木马"式的递送策略为抗真菌药物设计提供了新范式。研究还建立了氧化应激-线粒体功能障碍的作用机制模型，为克服真菌耐药性提供了多靶点干预思路。鉴于构巢曲霉在烧伤和导管相关感染中的临床意义，该成果对开发皮肤局部抗真菌制剂具有重要转化价值。未来研究可进一步优化铜负载比例，并探索与其他抗真菌剂的协同效应，为对抗"超级真菌"提供新武器。