N1-甲基假尿苷修饰的自扩增RNA通过RNA依赖性RNA聚合酶突变提升效能的机制研究

为解决自扩增RNA（saRNA）技术中核苷酸修饰导致复制效率降低的问题，研究人员通过突变VEEV（委内瑞拉马脑炎病毒）TC-83株的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），发现高保真突变体（如K290R）可部分恢复m1ψ修饰saRNA的复制能力，同时证实m5C修饰不影响复制效率。该研究为优化saRNA疫苗设计提供了新策略，发表于《Journal of Biological Chemistry》。

　　

在mRNA技术飞速发展的今天，自扩增RNA（saRNA）因其能在宿主细胞内自我复制并高效表达靶蛋白的特性，被视为疫苗和基因治疗的潜力股。然而，与传统mRNA不同，saRNA对核苷酸修饰的容忍度极低——临床常用的m¹ψ（N1-甲基假尿苷）修饰虽能提升翻译效率并降低免疫原性，却会严重损害saRNA的自我复制能力。这一矛盾成为制约saRNA技术应用的瓶颈。

为破解这一难题，来自阿根廷布宜诺斯艾利斯大学（Universidad de Buenos Aires）的研究团队以委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）TC-83减毒株为模型，展开了一场关于"聚合酶-模板适配性"的分子解密。他们发现，当saRNA中的尿苷被m¹ψ或ψ（假尿苷）完全取代时，RNA合成水平骤降100倍；而胞苷的m⁵C（5-甲基胞苷）修饰却对复制效率无影响。更有趣的是，通过引入与核苷酸类似物耐药性相关的RdRp突变（如K290R和C482Y），研究人员成功将m¹ψ修饰saRNA的复制能力提升2倍，且转染效率提高2.5倍。这项揭示"聚合酶保真性-修饰模板识别"新机制的研究，为设计更高效的saRNA疫苗提供了理论基石，成果发表于《Journal of Biological Chemistry》。

关键技术方法包括：1）构建含双荧光素酶报告基因的VEEV TC-83复制子系统；2）体外转录制备不同核苷酸修饰（m¹ψ、ψ、m⁵C）的saRNA；3）通过定点突变获得RdRp保真性变异体（K290R/C482Y/C482G）；4）使用BHK-21（干扰素缺陷）和A549（完整干扰素通路）细胞评估翻译与复制效率；5）免疫斑点分析仪定量GFP阳性病灶。

评估VEEV基saRNA的翻译与复制能力

研究人员设计了一种巧妙的双报告系统：Renilla荧光素酶直接反映输入saRNA的翻译效率，而firefly荧光素酶活性则表征saRNA复制能力。实验显示，m¹ψ和ψ修饰使RNA合成水平暴跌100倍，但m⁵C修饰的saRNA复制效率与未修饰组相当。值得注意的是，所有修饰均能提升初始翻译效率3倍，说明复制缺陷并非由翻译障碍导致。

调控VEEV RdRp活性

受抗病毒药物研究中"高保真突变体"启发，团队在nsP4 RdRp中引入三个关键突变。其中，位于保守基序F的K290R突变表现最突出：不仅使未修饰saRNA的ED50（半数有效剂量）降低2倍，更将m¹ψ修饰saRNA的转染效率从WT的25倍劣势缩减至10倍。通过剂量效应曲线证实，增加K290R突变体saRNA的剂量可完全克服m¹ψ的负面影响。

讨论与意义

该研究首次揭示：1）m⁵C是saRNA修饰的理想选择，兼具免疫原性低和复制兼容性双重优势；2）RdRp保真性调控是改善修饰saRNA效能的可行路径，特别是基序F的K290残基可能通过电荷相互作用影响修饰核苷酸的识别；3）为临床转化提供新思路——通过联合使用高保真聚合酶突变体和优化给药剂量，或可突破现有saRNA疫苗的技术壁垒。这些发现不仅解释了既往m¹ψ修饰saRNA动物实验失败的原因，更为下一代RNA疫苗设计提供了精准的分子调控靶点。