酵母Pah1磷脂酸磷酸酶活性位点基序的鉴定及其在脂质代谢与相关疾病中的机制研究

本研究通过序列比对和AlphaFold建模鉴定了酵母Pah1磷脂酸磷酸酶(PAP)活性位点的四个保守基序（I-IV），发现Arg-445是Pah1及其同源物特有的保守残基。突变分析表明这些保守残基对PAP活性和细胞功能至关重要，为人类脂蛋白磷酸酶突变引起的脂质相关疾病提供了分子机制基础。

　　

在真核细胞中，脂质代谢平衡对细胞生理功能至关重要。酵母Saccharomyces cerevisiae中的Pah1磷脂酸磷酸酶(PAP)通过将磷脂酸(PA)转化为二酰基甘油(DAG)，在调控三酰基甘油(TAG)储存和膜磷脂合成中发挥核心作用。然而，Pah1催化机制的关键活性位点尚未完全阐明，这限制了对人类同源蛋白lipin突变所致疾病的理解。

美国罗格斯大学的研究人员通过整合生物信息学分析和实验验证，系统研究了Pah1的催化机制。研究发表在《Journal of Biological Chemistry》上，采用的关键技术包括：1) 基于AlphaFold的蛋白质结构预测建模；2) 位点特异性突变构建；3) 磷脂酶活性测定；4) 脂质组学分析；5) 亚细胞定位观察；6) 有限蛋白酶解分析。

活性位点基序鉴定与功能分析

通过序列比对和AlphaFold建模，研究人员鉴定了Pah1 HAD样结构域中的四个保守活性位点基序（I-IV），并发现Arg-445是Pah1及其同源物特有的新保守残基。构建的D398E（基序I）、T443L（基序II）、K496A（基序III）和N530A（基序IV）等突变体几乎完全丧失PAP活性，证明这些残基对催化功能至关重要。

细胞表型互补实验

活性位点突变体无法恢复pah1Δ菌株的表型缺陷：TAG水平降低85-95%、脂滴数量减少、核膜形态异常、磷脂合成基因CHO1表达上调。仅保留微弱活性的G529A突变体部分恢复了这些表型，表明PAP活性与细胞功能直接相关。

酶动力学与结构分析

纯化的突变体酶在体外完全丧失活性，无法测定动力学参数。有限蛋白酶解显示突变不影响Pah1整体结构，脂质体结合实验证实突变体仍能正常结合膜结构，表明活性缺陷源于催化机制而非定位异常。

该研究首次系统鉴定了Pah1 PAP活性的四个关键基序，揭示了保守残基在催化中的核心作用。特别值得注意的是，基序II的Arg-445是Pah1/lipin家族特有的残基，可能决定了这类酶对PA底物的特异性。研究还发现人类lipin1/2中对应位点的突变（R725H和S734L）与横纹肌溶解症和马吉德综合征直接相关，为这些脂质相关疾病的分子诊断和治疗提供了新靶点。这些发现不仅完善了对PAP催化机制的认识，也为开发针对lipin突变相关疾病的干预策略奠定了理论基础。