基于在线纳分级技术的流感病毒PAN/PAN I38T抑制剂高通量筛选平台构建及艾蒿活性成分发现

本研究针对流感病毒PAN靶点抑制剂筛选效率低的技术难题，创新性构建了HPLC-HRMS联用FRET核酸酶活性检测的在线纳分级（ANF）高通量筛选平台，从艾蒿水提物中鉴定出17种PAN抑制剂，其中cynarine等三种化合物对PAN I38T突变株抑制活性优于临床药物baloxavir，为抗耐药流感药物开发提供新策略。

　　

【研究背景】

流感病毒每年导致全球65万人死亡，而临床常用的神经氨酸酶（NA）抑制剂面临日益严重的耐药问题。病毒RNA聚合酶的PA_N末端因其高度保守的核酸酶活性位点成为抗流感新靶点，但现有唯一临床药物baloxavir marboxil（BXM）存在副作用且对I38T突变株敏感性降低。传统生物活性导向分离（BGF）方法耗时长、低丰度成分易丢失，亟需建立高效筛选技术从复杂中药体系中发现新型PA_N抑制剂（PA_NIs）。

【研究方法】

广东一方制药有限公司与相关研究团队创新性地将高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）与基于FRET的核酸酶活性检测通过在线纳分级系统（ANF）联用，构建高通量筛选平台。通过优化色谱分离条件（RD-C₁₈柱，甲醇-0.1%甲酸梯度洗脱）、生物检测参数（20 μL反应体系含0.5% NP-40的Tris-HCl缓冲液）及分馏频率（9秒/孔），实现单次进样同步获取化学成分与活性数据。采用384孔板自动收集馏分，通过斜率法计算酶活性抑制率，并利用AutoDock Vina进行分子对接验证。

【主要结果】

3.1 平台优化与验证

• 酶活性检测优化：确定PA_N最佳稀释比1:5和探针浓度25 nM，Z'因子达0.77

• 分馏参数确认：9秒/孔分馏频率保持色谱分辨率，20 μL反应体积提高检测灵敏度10倍

• 灵敏度验证：可检测10 μM浓度baloxavir（IC₅₀=9.11 μM）

3.2 艾蒿活性成分筛选

• 从13种中药水提物中筛选出艾蒿提取物活性最强（IC₅₀=6.15 μg/mL）

• 鉴定17种PA_N抑制剂，包括8种咖啡酰奎宁酸（CQAs）、5种黄酮类化合物

• 关键活性成分：cynarine（IC₅₀=23.69 μM）、isochlorogenic acid C（IC₅₀=22.85 μM）对PA_N I38T抑制活性优于baloxavir（IC₅₀=12.88 μM）

3.3 分子相互作用机制

• 活性成分通过羟基与Mn²⁺螯合，并与Tyr24、His41等关键氨基酸形成氢键

• Isochlorogenic acid C结合能达-8.985 kJ/mol，通过三环骨架深度插入催化口袋

【研究意义】

该研究建立的ANF-HRMS-FRET三联技术平台突破了传统中药活性成分筛选效率瓶颈，首次实现PA_N抑制剂的高通量发现。从艾蒿中鉴定的多酚类化合物为设计广谱抗流感药物提供了新骨架，特别是对I38T突变株的有效抑制为临床耐药问题提供解决方案。相关成果发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》，为中药现代化研究提供了技术范式。