环状RNA适配体通过增强结合力与稳定性突破HIV-1 Tat靶向治疗瓶颈

本研究针对RNA适配体在生理条件下的不稳定性问题，通过T4 RNA连接酶构建环状HIV-1 Tat RNA适配体，结合迁移率实验、RNase R消化和1D imino质子核磁共振(NMR)等技术证实其结构稳定性。结果显示环状适配体结合亲和力提升10倍，细胞内半衰期延长至18小时，为基于RNA的抗病毒治疗提供新策略。

　　

在生物医学领域，RNA适配体因其高特异性和低免疫原性被视为极具潜力的分子探针，但其临床应用长期受限于生理环境中的不稳定性——外切核酸酶降解和结构易变性成为主要障碍。尤其对于HIV-1 Tat蛋白这类关键病毒调控因子，虽然已有研究表明线性RNA适配体可抑制其转录激活功能，但细胞内快速降解严重制约了治疗效果。

针对这一挑战，扎加齐格大学药学院的研究团队创新性地将环状RNA技术应用于HIV-1 Tat RNA适配体的改造。发表于《Methods》的这项研究首次系统证实：通过共价闭合的环状结构设计，不仅能显著提升适配体的核酸酶抗性，还可意外增强其靶标结合能力。这一发现为RNA药物的开发提供了双重优化策略。

研究团队采用四项关键技术：T7 RNA聚合酶体外转录合成线性前体、T4 RNA连接酶介导的环化反应、基于Native PAGE和RNase R消化的拓扑结构验证，以及突破性的实时监测手段——in-cell NMR（细胞内核磁共振）技术。其中in-cell NMR实现了活细胞内RNA结构与动力学的原子级分辨率观测，为评估治疗性核酸的生理环境行为建立了金标准。

【RNA合成、环化与纯化】

通过优化T7 RNA聚合酶转录体系获得高纯度线性RNA前体，经T4 RNA连接酶处理形成共价闭合环状结构。高效液相色谱纯化后，产物纯度达98%，满足后续结构分析需求。

【环化验证】

Native PAGE显示环状产物迁移率显著低于线性对照（图2A）；RNase R消化实验证实环状结构完全抵抗外切酶降解，而线性对照30分钟内完全分解。这两项正交实验确证了环状拓扑结构的成功构建。

【结合亲和力评估】

滤膜结合实验显示环状适配体对Tat蛋白的K_d值较线性版本降低10倍，表明环化不仅未破坏结合位点，反而通过稳定三维构象增强了相互作用。

【结构稳定性分析】

1D imino质子NMR谱显示环状适配体保留所有特征峰，CLEANEX-PM实验揭示其溶剂交换速率降低3倍，证实环化显著提升结构刚性。尤其值得注意的是Watson-Crick碱基配对完整性得到保持，说明功能构象未受环化影响。

【细胞内持久性】

in-cell NMR追踪显示：转染至HeLa细胞后，环状适配体信号持续18小时仍可检测，而线性版本4小时内完全降解。这种近5倍的半衰期延长，首次直接证实环状结构在真实细胞环境中的稳定性优势。

这项研究的突破性在于：首次将RNA环化、结构生物学和细胞动态监测技术整合，建立了一套完整的治疗性RNA优化评价体系。环状HIV-1 Tat适配体展现的"双增强"效应（结合力与稳定性同步提升），颠覆了传统认为结构改造必然牺牲功能的认知。其揭示的构象稳定化机制——通过共价闭环限制非功能构象、保护关键碱基配对——为设计新一代抗病毒RNA药物提供了普适性指导。

特别值得关注的是，研究建立的in-cell NMR技术平台，能够在不干扰细胞生理状态下实时观测RNA药物的构象变化与降解途径，这一技术将加速治疗性核酸的临床转化进程。随着环状RNA制备工艺的成熟，该策略有望拓展至其他疾病靶点，推动RNA疗法进入更广阔的临床应用领域。