通过罗丹明B荧光猝灭技术开发并验证了一种用于检测血浆中MHPG的光谱荧光方法：采用Box-Behnken设计方法，并将其应用于自闭症谱系障碍的研究

《Microchemical Journal》：Development and validation of a spectrofluorimetric method for MHPG detection in plasma via rhodamine B fluorescence quenching: a Box-Behnken design approach with application to autism spectrum disorder

本研究开发并验证了一种基于罗丹明B荧光淬灭的高灵敏度MHPG检测方法，通过UV-Vis和荧光光谱表征证实了1:1离子对复合物的静态淬灭机制，并利用Box-Behnken设计优化pH、染料体积和孵育时间（最佳条件：pH 10.0，620 μL染料，12 min孵育），建立线性范围2-200 ng/mL，检测限0.655 ng/mL的可靠方法。应用于ASD儿童与正常对照组，发现ASD组血浆MHPG水平升高但未达显著差异，且年龄相关性变化模式存在性别特异性差异，为研究ASD的 noradrenergic系统紊乱提供了新工具。

　　这项研究致力于开发并验证一种高灵敏度的荧光光谱法，用于检测3-甲氧基-4-羟基苯乙醇（MHPG），这是一种去甲肾上腺素的主要代谢产物，也被视为中枢去甲肾上腺素系统活动的指标。研究基于罗丹明B的荧光猝灭现象，通过紫外-可见光谱和荧光光谱技术对罗丹明B的光谱特性及其与MHPG形成的离子对复合物进行了深入分析。通过机制研究，包括斯特恩-沃尔默动力学、热力学分析以及乔布连续变化法，研究揭示了罗丹明B与MHPG之间存在静态猝灭模式，并且其复合物的形成比例为1:1。通过采用实验设计方法，特别是Box-Behnken设计，对影响罗丹明B-MHPG相互作用的关键参数如pH值、罗丹明B体积和孵育时间进行了优化，分析结果表明在pH 10.0、620 μL罗丹明B和12分钟孵育条件下，可以最大程度提高猝灭效率和方法的灵敏度。该方法按照国际协调会议（ICH）M10指南进行了严格验证，表现出良好的线性范围（2–200 ng/mL）、精密度、准确性和选择性，其检测下限和定量下限分别为0.655和1.966 ng/mL。研究还应用该方法对一组自闭症谱系障碍（ASD）儿童和正常对照组进行了初步分析，发现ASD组的血浆MHPG水平较高，但差异未达到统计学显著性。值得注意的是，MHPG水平随年龄变化的趋势在两个组别之间存在显著差异，正常对照组中观察到稳健的正相关，而ASD组则未表现出这种趋势。此外，性别特异性分析进一步表明，ASD患者中去甲肾上腺素功能的性别差异比正常对照组更为明显。这些初步结果为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化提供了有价值的见解，并突显了所开发的荧光光谱方法的实用性，提示需要在更大样本量的队列中进一步研究，以明确去甲肾上腺素功能紊乱在ASD中的临床意义。

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，主要特征包括社交互动的困难、沟通能力的缺陷以及重复行为或受限兴趣的存在。随着全球范围内对ASD认识的加深和诊断技术的改进，该疾病的发病率正在显著上升。在美国，目前估计每36名儿童中就有1名受到影响，而在全球范围内，这一比例约为每100名个体中1人。近年来，发病率的上升主要归因于更高的公众意识、更精确的诊断标准以及更广泛的疾病定义。这一趋势强调了寻找可靠生物标志物的迫切需求，以支持早期诊断和干预策略的实施。多项研究表明，不同神经递质系统的调节紊乱可能是导致ASD病理机制的关键因素之一。其中，去甲肾上腺素系统因其在觉醒、注意力和社交行为中的重要作用而受到特别关注。MHPG作为去甲肾上腺素的主要代谢产物，被认为是衡量去甲肾上腺素系统活动的重要指标，能够反映大脑和周围组织中去甲肾上腺素的代谢周转情况。

MHPG水平的改变与多种神经系统疾病有关。例如，在阿尔茨海默病中，脑脊液中MHPG浓度的升高通常与去甲肾上腺素活动的增强相关，这可能影响认知功能、注意力和行为表现。然而，在ASD中，关于MHPG水平的研究结果却存在矛盾，一些研究报道MHPG水平降低，而另一些研究则发现其浓度保持不变。这种差异可能源于ASD的异质性，以及研究人群和生物样本类型的差异（如血浆、尿液或脑脊液）。此外，年龄和性别也被认为是影响个体MHPG水平的重要因素，这进一步增加了对结果解释的复杂性。这些不一致的结果突显了开发更加敏感、可靠的分析方法的必要性，以准确量化MHPG并解决文献中的矛盾。

目前，MHPG的定量分析方法主要包括高效液相色谱（HPLC）结合电化学检测或液相色谱-质谱（LC-MS）等技术。虽然这些方法在灵敏度和特异性方面表现出色，但它们也存在一些显著的局限性：需要昂贵的仪器设备、复杂的样本前处理过程、专业的操作人员，且通常具有较低的通量。这些限制强调了在临床和研究环境中寻找更简单、更易操作的分析方法的必要性。荧光光谱法作为一种替代手段，展现出诸多优势，如高灵敏度、相对简便的操作流程、成本效益以及潜在的高通量分析能力。近年来，荧光探针在生物样本中检测多种分析物的应用日益广泛，因其具有快速的响应时间和操作简便性而受到关注。随着荧光探针技术的不断发展，其应用范围已扩展至多种分析目标，包括用于疾病生物标志物检测的蛋白酶、用于遗传分析的单核苷酸变异以及用于分子诊断的RNA检测等。这些发展表明，基于荧光的分析方法在生物和临床应用中的多样性和重要性日益增强。

在众多荧光探针中，罗丹明B因其在MHPG检测中的潜力而被认为是一个特别有前景的候选者。罗丹明B具有优异的光物理特性，包括在可见光谱区域的强吸收和发射，高量子产率（Φ > 0.5），大摩尔消光系数以及良好的光稳定性。此外，其荧光信号可以通过多种机制进行调控，包括静态猝灭和动态猝灭，其中分析物的存在会导致荧光信号的减弱。罗丹明B的黄烷酮结构，特别是其内酯环和羧基，为与MHPG形成离子对复合物提供了潜在的结合位点，这可能导致可测量的荧光猝灭现象。为了开发一种稳健的荧光光谱法，系统地优化实验条件是至关重要的。实验设计方法（DoE）相比传统的单因素优化方法具有显著优势，能够同时评估多个因素及其相互作用，同时减少所需的实验次数。已有研究表明，DoE在优化基于荧光猝灭的分析方法方面表现出色，能够有效提高分析的灵敏度。通过应用Box-Behnken设计，可以系统地优化影响罗丹明B-MHPG相互作用的关键参数，如pH值、试剂浓度和反应时间，从而提升方法的性能。

本研究的主要目标是开发一种高灵敏度和高选择性的基于罗丹明B荧光猝灭的荧光光谱法，用于检测和量化MHPG。据我们所知，这是首次使用荧光光谱技术对这一重要的生物标志物进行定量分析。本研究涵盖了多个关键组成部分：（1）利用紫外-可见光谱和荧光光谱技术对罗丹明B及其与MHPG形成的离子对复合物进行全面的光谱表征；（2）阐明罗丹明B与MHPG之间相互作用的机制，重点关注离子对复合物的形成；（3）通过Box-Behnken设计优化实验条件，以最大程度提高方法的灵敏度；（4）按照国际协调会议（ICH）M10指南对方法进行严格验证，确保其适用于生物分析；（5）将验证后的分析方法应用于比较ASD儿童与正常对照组的血浆MHPG水平，并评估年龄和性别对两组间MHPG水平的影响。总体而言，本研究旨在提供一种可靠、易用的MHPG量化工具，同时为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化做出贡献。

在材料和试剂部分，MHPG（纯度≥98%）购自MedChemExpress公司（美国新泽西州Monmouth Junction）。罗丹明B（染料含量≥95%）则来自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州St. Louis）。HPLC级的乙醇和乙腈也从Sigma-Aldrich公司获得。分析级试剂，包括盐酸、醋酸、磷酸、氢氧化钠、硼酸以及各种缓冲盐，购自Piochem公司（埃及开罗）。实验中使用的其他化学试剂均按照标准操作流程进行处理和配制，以确保实验条件的稳定性和数据的可靠性。

在罗丹明B和其与MHPG相互作用的光谱特性部分，罗丹明B表现出典型的紫外-可见吸收光谱，其在可见光谱区域具有显著的吸收峰，尤其是在544 nm附近，这与溶液中其鲜艳的粉红色有关。然而，MHPG在紫外-可见光谱范围内没有明显的吸收，仅在光谱中表现出微弱的吸光度。为了确认罗丹明B与MHPG之间形成离子对复合物的机制，实验采用了光谱滴定方法。通过逐步增加MHPG的浓度，观察罗丹明B荧光信号的变化，可以进一步验证其与MHPG之间的相互作用。此外，研究还利用荧光光谱技术分析了罗丹明B在不同浓度下的荧光特性，以评估其与MHPG形成复合物的条件和稳定性。通过结合紫外-可见光谱和荧光光谱的综合数据，研究人员能够更全面地理解罗丹明B在检测MHPG过程中的行为特征。

在实验设计和优化过程中，研究人员采用Box-Behnken设计对多个关键参数进行了系统优化。这一设计方法能够有效评估多个因素及其相互作用，从而在减少实验次数的同时提高方法的灵敏度和准确性。优化的参数包括pH值、罗丹明B的体积以及孵育时间。通过分析这些参数对罗丹明B-MHPG相互作用的影响，研究人员确定了最佳的实验条件，即pH 10.0、620 μL罗丹明B和12分钟的孵育时间。这些条件被选择为能够最大程度提高猝灭效率和方法灵敏度的参数组合。此外，研究还采用了期望函数分析，以进一步优化实验条件，确保方法在实际应用中的稳定性。

在方法验证过程中，研究人员严格按照ICH M10指南对方法进行了全面评估，确保其在生物分析中的适用性。验证内容包括线性范围、精密度、准确性和选择性等关键指标。实验结果显示，该方法在2–200 ng/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系，同时在重复性和再现性方面也达到较高的标准。此外，方法的准确性和选择性均得到了验证，确保其能够可靠地检测和量化MHPG。该方法的检测下限和定量下限分别为0.655和1.966 ng/mL，表明其具有较高的灵敏度和适用性。

在实际应用方面，研究人员将该方法应用于一组ASD儿童和正常对照组的血浆样本，以比较两组之间的MHPG水平。初步结果表明，ASD组的血浆MHPG水平较高，但差异未达到统计学显著性。这一结果可能受到样本量较小的影响，需要在更大的队列中进一步验证。此外，研究还评估了年龄和性别对两组间MHPG水平的影响，发现年龄相关的趋势在两个组别之间存在显著差异。在正常对照组中，MHPG水平随着年龄的增长呈现出稳健的正相关，而在ASD组中则未观察到这种趋势。这可能提示在ASD患者中，MHPG水平的变化与年龄之间的关系不同于正常人群。性别特异性分析进一步表明，在ASD患者中，去甲肾上腺素功能的性别差异比正常对照组更为显著。这可能与ASD的性别比例失衡以及个体间去甲肾上腺素系统功能的差异有关。

本研究的初步结果表明，MHPG水平在ASD患者中可能呈现出一定的变化趋势，但这些变化尚未达到统计学显著性。这可能与研究样本量较小有关，因此需要在更大规模的队列中进一步研究，以明确去甲肾上腺素功能紊乱在ASD中的临床意义。此外，研究还发现，年龄和性别在影响MHPG水平方面可能具有重要作用，这提示在未来的分析中，需要更加关注这些变量对结果的影响。这些结果不仅为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化提供了有价值的见解，也为开发基于荧光猝灭的分析方法在临床和研究中的应用提供了依据。

在研究的结论部分，研究团队指出，本研究成功开发并验证了一种基于罗丹明B荧光猝灭的高灵敏度荧光光谱法，用于检测MHPG，并将其应用于比较ASD儿童与正常对照组的血浆样本。研究结果显示，该方法能够有效检测和量化MHPG，表现出良好的线性关系、精密度、准确性和选择性。此外，该方法在检测下限和定量下限方面也达到较高的标准，表明其具有较高的灵敏度和适用性。研究还发现，MHPG水平在ASD组和正常对照组之间存在一定的差异，但这些差异尚未达到统计学显著性。这一结果可能受到样本量的限制，因此需要在更大的队列中进一步研究。此外，研究还发现，年龄和性别在影响MHPG水平方面可能具有重要作用，这提示在未来的分析中，需要更加关注这些变量对结果的影响。

研究团队还指出，本研究的初步结果为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化提供了重要的线索。这些结果表明，MHPG水平在ASD患者中可能呈现出一定的变化趋势，但这些变化尚未达到统计学显著性。这可能与ASD的异质性有关，因此需要在更大规模的队列中进一步研究，以明确去甲肾上腺素功能紊乱在ASD中的临床意义。此外，研究还发现，年龄和性别在影响MHPG水平方面可能具有重要作用，这提示在未来的分析中，需要更加关注这些变量对结果的影响。这些结果不仅为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化提供了重要的线索，也为开发基于荧光猝灭的分析方法在临床和研究中的应用提供了依据。

研究团队在论文中还对作者的贡献进行了说明，Razaz Abdulaziz Felemban和Majed A. Algarni负责撰写和编辑论文，设计实验方法并进行数据分析。Ayman A. Abd Al Maksoud则负责撰写和编辑论文、设计实验方法、进行实验调查和数据分析，并提出了研究的概念。Adnan Alharbi负责实验方法的设计、实验调查和数据分析。此外，所有作者均参与了研究的构思和实施，确保了研究的全面性和科学性。

研究团队还提到，该研究得到了沙特阿拉伯塔伊夫大学的资助，项目编号为TU-DSPP-2024-154。研究团队声明，他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究的成果。研究团队对塔伊夫大学提供的支持表示感谢，特别感谢该项目的支持。

综上所述，本研究开发了一种基于罗丹明B荧光猝灭的高灵敏度荧光光谱法，用于检测MHPG，并将其应用于比较ASD儿童与正常对照组的血浆样本。研究结果显示，该方法能够有效检测和量化MHPG，表现出良好的线性关系、精密度、准确性和选择性。此外，该方法在检测下限和定量下限方面也达到较高的标准，表明其具有较高的灵敏度和适用性。研究还发现，MHPG水平在ASD组和正常对照组之间存在一定的差异，但这些差异尚未达到统计学显著性。这可能与研究样本量较小有关，因此需要在更大的队列中进一步研究，以明确去甲肾上腺素功能紊乱在ASD中的临床意义。此外，研究还发现，年龄和性别在影响MHPG水平方面可能具有重要作用，这提示在未来的分析中，需要更加关注这些变量对结果的影响。这些结果不仅为理解ASD中去甲肾上腺素系统的潜在变化提供了重要的线索，也为开发基于荧光猝灭的分析方法在临床和研究中的应用提供了依据。