菠萝蛋白酶催化的鱼和禽副产品水解：一种可持续的生物肽生产方法

《Next Research》：Bromelain-catalyzed hydrolysis of fish and poultry by-products: a sustainable approach to biopeptide production

本研究利用菠萝蛋白酶水解鱼和禽类副产品，优化酶与底物比（E/S）和反应时间，获得高蛋白含量（FH 70.8%，PH 56.3%）及显著抗氧化（FH 249.02，PH 144.41 μmol eq. Trolox/g）和ACE抑制活性（FH IC50 693 μg/mL，PH 1585 μg/mL）。水解物能有效支持益生菌生长，1%浓度即可替代传统培养基中的氮源，为资源循环利用和功能性食品开发提供新方案。

　　本研究旨在利用菠萝副产品中提取的酶——菠萝蛋白酶，从鱼类和禽类副产品中开发具有生物活性的蛋白质水解产物，以探索其在食品和生物技术领域的潜在应用。随着全球高蛋白食品消费量的显著增长，肉类和鱼类工业每天都会产生大量低价值的副产品，这不仅带来了经济上的挑战，也对环境造成了一定压力。这些副产品富含蛋白质，因此成为提取生物活性化合物的潜在资源。通过多因素设计优化水解过程，研究确定了最佳的水解条件：对于鱼类副产品，酶与底物比例为1.3%，水解时间为240分钟；而对于禽类副产品，酶与底物比例为2.0%，水解时间为180分钟。基于这些优化条件，成功地生产并放大了鱼类（FH）和禽类（PH）水解产物。

这些水解产物表现出较高的蛋白质含量（FH为70.8 ± 0.1%，PH为56.3 ± 1.0%），显著的抗氧化活性（ORAC值为249.02 ± 4.71 μmol eq. Trolox/g对于FH，以及144.41 ± 11.62 μmol eq. Trolox/g对于PH），以及良好的ACE抑制效果（IC??值分别为693 ± 12 μg蛋白质/mL和1585 ± 6 μg蛋白质/mL）。此外，这些水解产物在促进益生菌株生长方面也表现出显著的潜力，其中1%（w/v）的FH或PH在支持乳酸菌Lactobacillus casei 01方面与传统培养基表现出相似的效果（p > 0.05）。这些结果突显了由菠萝蛋白酶衍生的水解产物作为传统氮源的可持续、低成本替代品的潜力，可用于功能性发酵食品或微生物培养基的配方中。

本研究不仅为农业工业副产品创造了价值，还符合全球可持续发展倡议，推动了循环生物经济的发展。随着人们对高质量蛋白质在日常饮食中重要性的认识加深，科学研究逐渐关注于寻找环保、可持续且有助于健康的产品。酶水解技术能够生产具有高水解度的蛋白质水解产物，从而提高其产量，并促进小肽的释放，增强其生物活性。例如，鱼类水解产物（FHs）和禽类水解产物（PHs）已显示出通过血管紧张素I转化酶（ACE）抑制机制的降压活性，以及抗氧化活性。研究还发现，来源于禽类骨骼和羽毛副产品的蛋白质水解产物在促进益生菌生长方面尤为有效。因此，蛋白质水解产物可以作为微生物培养基中的替代氮源，也可以作为功能性发酵食品的配料，赋予其额外的健康益处。

在本研究中，Borges等人使用了菠萝蛋白酶进行鱼类和禽类副产品的水解，这是对以往研究的一个创新。通常情况下，蛋白酶如碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶被用于从动物蛋白质来源中提取生物活性肽。尽管这些酶已被广泛研究和应用，但本研究探索了菠萝蛋白酶在水解多种动物副产品中的有效性。菠萝蛋白酶是一种独特的酶，因其具有多种结合位点，可以催化广泛的蛋白水解反应。此外，菠萝蛋白酶的特定催化残基，如半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺，对于其活性至关重要，这些残基有助于其切断肽键并提高蛋白酶效率。因此，本研究不仅评估了菠萝蛋白酶在肽生成方面的效果，还探讨了其在益生菌生长和功能性食品应用中的潜力，这在以往的研究中较少涉及。

菠萝蛋白酶是一种在菠萝属植物中发现的酶复合物，主要存在于菠萝果实中，由内肽酶、碳水化合物和糖蛋白组成。虽然这种酶复合物通常从整个果实中提取，这可能对环境和经济造成一定影响，但其也可在菠萝残留物的不同部分中找到，如茎和果皮。菠萝蛋白酶在食品工业中已有广泛应用，如肉类嫩化、抗褐变活性以及酒精发酵过程。最近的研究表明，菠萝蛋白酶也可以用于水解动物副产品，如猪肝和鱼皮。然而，目前的研究主要集中在有限的底物上，对于由这种酶水解动物副产品所得到的水解产物的功能性应用信息仍然不足。因此，本研究填补了这一研究空白，通过生产并放大由菠萝蛋白酶水解的鱼类和禽类副产品，评估其抗氧化和ACE抑制活性，以及其对益生菌生长的促进作用，展示了其在微生物培养基和功能性发酵食品配方中的双重潜力。

研究中，使用多因素设计优化水解过程，评估了关键参数如酶与底物的比例和水解时间。研究设计包括20个独立的随机实验，变量包括酶与底物的百分比和水解时间。考虑到鱼类和禽类蛋白质的差异，特别是禽类蛋白质中胶原蛋白和弹性蛋白含量较高，这可能会阻碍酶的水解作用，因此对禽类副产品的水解采用了更高的酶浓度范围。同时，一些研究表明，酶活性在反应的早期阶段最为有效，此时底物更易接近，酶-底物相互作用更有利于反应进行。因此，选择了最大水解时间为240分钟，以平衡效率和潜在工业应用的可行性。在每个确定的水解时间点，取样以监测酶水解过程的进展，然后在特定取样点将样品加热至100°C 15分钟以终止酶活性。酶失活后，样品经离心处理，收集上清液，并将其冷冻干燥，以进行后续的分析。

在水解产物的表征方面，研究评估了其近似成分、矿物质含量、吸湿性以及分子量分布。通过近似成分分析，发现FH的蛋白质含量显著高于PH，这可能是由于鱼类蛋白质在水解过程中的溶解性和酶效用更高，而禽类蛋白质由于含有更多的胶原蛋白和弹性蛋白，这些蛋白质在水解过程中不易溶解。因此，尽管禽类的初始蛋白质含量高于鱼类，但实际水解产物中的蛋白质含量较低。此外，研究还分析了水解产物中的矿物质含量，发现FH和PH中主要的矿物质包括钾、钠和磷，其中FH含有较高的镁、铜和硒。这表明，这些水解产物可能在营养和健康方面具有独特优势。同时，吸湿性分析结果显示，FH的吸湿性较低，属于轻微吸湿性，而PH的吸湿性较高，属于中度吸湿性。这种差异可能与水解产物中肽的大小有关，较小的肽具有较高的比表面积和更多的极性基团，从而增加了其与水分子的相互作用。

分子量分布分析进一步揭示了FH和PH的组成特点。FH和PH均含有小于10 kDa的肽，但FH还包含少量大于10 kDa和50 kDa的肽。这可能与菠萝蛋白酶的特异性有关，其作为半胱氨酸蛋白酶，倾向于切割含有半胱氨酸的肽键。因此，FH中的肽可能具有更高的生物活性。此外，低分子量肽更容易穿透肠道膜，从而提高其生物利用度。这些肽在体内的生物活性，如抗氧化和抗高血压作用，与其分子量密切相关。研究表明，低分子量肽具有更高的生物稳定性，能够在体内有效发挥功能。因此，了解肽的分子量分布对于评估其生物活性至关重要。

在生物活性评估方面，研究使用了ABTS和ORAC方法评估FH和PH的抗氧化活性，结果表明FH的抗氧化活性显著高于PH。此外，通过ACE抑制实验评估了FH和PH的抗高血压活性，发现FH的IC??值较低，表明其在抑制ACE活性方面更为有效。这与之前的报道一致，即一些鱼类蛋白水解产物在抑制ACE方面表现出良好的效果。研究还评估了这些水解产物对益生菌生长的影响，发现1%（w/v）的FH或PH能够有效支持Lactobacillus casei 01的生长，与传统培养基的效果相当。对于L. rhamnosus LGG，PH在1%（w/v）浓度下也能支持其生长，但需要更高的浓度才能维持最佳生长效果。这些结果表明，这些水解产物可以作为传统氮源的替代品，具有实际应用价值。

本研究的结论表明，通过酶水解有效利用动物副产品是解决工业废弃物经济和环境挑战的一种有前景的方法。将低价值的动物副产品转化为高价值的生物活性蛋白质水解产物，不仅符合全球减少食物损失和浪费的目标，也与联合国可持续发展目标相一致。通过多因素设计优化水解条件，研究确定了最佳的酶与底物比例和水解时间，成功生产了具有高蛋白质含量、显著抗氧化活性和良好ACE抑制效果的FH和PH。此外，这些水解产物在促进益生菌生长方面表现出良好的潜力，进一步证明了其在微生物培养基和功能性发酵食品中的应用前景。

本研究为农业工业副产品的价值创造提供了新的思路，同时也为可持续发展提供了支持。然而，研究也指出，由于动物副产品的生化组成存在批次间的差异，可能会影响水解产物的再现性。因此，在工业应用中需要进一步关注这一因素。此外，虽然本研究展示了水解产物的显著生物活性，但未来的研究应集中在氨基酸组成和特定肽序列的识别与表征，以更深入地理解其结构-功能关系，并进一步验证其功能潜力。同时，这些水解产物在功能性食品配方中的应用，尤其是在实际食品基质中的表现，也值得进一步探索。通过这些努力，可以推动更可持续和营养丰富的食品系统的建设。