基于PNA-LNA分子开关技术的结直肠癌KRAS/BRAF突变谱分析及其临床意义

本研究针对结直肠癌(CRC)靶向治疗中KRAS/BRAF突变检测的临床需求，开发了PNA-LNA分子开关技术，实现了在40分钟内快速检测原发性肿瘤和循环肿瘤细胞(CTC)中KRASG12V和BRAFV600E突变。结果显示该方法与NGS一致性达89%，且发现CTC中KRAS突变与淋巴结转移(p=0.002)等临床参数显著相关，为CRC精准诊疗提供了新型快速检测方案。

　　

在结直肠癌(CRC)治疗领域，KRAS和BRAF基因突变检测是决定抗EGFR靶向治疗方案的关键。然而传统检测方法如Sanger测序耗时长(需1周)、NGS成本高(约65澳元/次)，且难以实时监测肿瘤异质性。更棘手的是，循环肿瘤细胞(CTC)作为"液体活检"标志物，其突变谱常与原发肿瘤不一致，但现有技术对CTC突变检测的灵敏度不足，无法满足临床需求。

澳大利亚格里菲斯大学(Griffith University)的研究团队创新性地开发了PNA-LNA分子开关技术。该技术巧妙结合肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)的特性：PNA探针特异性结合野生型序列阻断扩增，而LNA引物选择性增强突变序列的等温扩增(LAMP)。通过荧光信号和比色法双检测，可在40分钟内完成突变分析，成本仅7.5澳元/次，灵敏度达1个DNA拷贝/μl。

研究团队采用三项关键技术：1) 从71例CRC患者原发肿瘤和37例CTC样本中提取DNA；2) 设计特异性PNA探针和LNA引物靶向KRAS^G12V/BRAF^V600E；3) 通过荧光LAMP反应和NGS验证。结果显示：原发肿瘤中KRAS和BRAF突变率分别为36.6%和26.8%，CTC中为26.8%和19%。特别值得注意的是，CTC中KRAS突变与淋巴结转移(p=0.002)、病理分期(p=0.005)和淋巴管浸润(p=0.034)显著相关，而原发肿瘤突变未见此关联。

在"KRAS突变频率"部分，研究发现11例(30%)患者CTC与原发肿瘤同时存在KRAS突变，但2例(5%)出现CTC特异性突变，提示肿瘤异质性。"BRAF突变频率"数据显示7例(19%)患者双阳性，而2例(5%)CTC独有突变进一步证实克隆进化。技术验证部分显示，与NGS相比，该方法对KRAS/BRAF检测的总体符合率达89%(p<0.001)，但能检出NGS漏诊的4例突变，凸显其高灵敏度。

讨论部分指出，该技术突破传统方法局限：耗时从数天缩短至40分钟，成本降低近90%，且操作简便适合基层应用。特别重要的是，首次发现CTC中KRAS突变与淋巴转移的强关联，为预后评估提供了新指标。局限性在于目前仅能检测已知SNP，未来需扩展至多靶点检测。该成果发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》，为CRC精准医疗提供了革命性的快速诊断工具，尤其适合资源有限地区的靶向治疗筛查。通过实时监测CTC突变动态，有望实现"伴随诊断"指导个体化治疗。