提高年轮可见度：62种温带树种的样本采集与成像技术比较研究

《Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography》：Enhancing tree-ring visibility: A comparative study of sample and imaging techniques for 62 temperate tree species

年轮可视化技术在温带散孔材与半环孔材中应用研究，比较了三种制备方法（微切面、微切面加白垩、双染色薄切片）与四种成像技术（可见光、紫外、GFPA、RFP1滤镜）的效能，发现双染色薄切片结合可见光显微成像能最清晰展现年轮界限，且白垩处理微切面为次优方案，荧光技术虽部分有效但整体不优于传统方法。

　　

摘要

树木生长模式蕴含了关于森林动态、生态过程和环境变化的宝贵信息。然而，提取这些信息需要精确地可视化年轮边界。虽然具有明显年轮边界的物种（例如针叶树和环孔材阔叶树）已被广泛研究，但扩散孔材和半环孔材物种尽管在生态上非常重要，却仍然研究不足。为填补这一知识空白，需要改进针对这些难处理物种的年轮可视化技术，以实现其可靠的测量和交叉定年。在这项研究中，我们评估了多种样品制备和成像技术对东亚和北美62种sensu lato温带树种年轮可见性的提升效果。我们比较了三种制备方法：使用核微切片机处理后的增量芯材（是否涂有白垩）以及双染色薄切片。这些方法结合了四种成像技术：可见光显微镜和荧光显微镜（使用紫外光（UV）、绿色荧光蛋白A（GFPA）和红色荧光蛋白1（RFP1）滤光片）。结果表明，双染色薄切片在可见光下的年轮边界最为清晰，其次是涂有白垩的增量芯材在可见光下的效果。在荧光技术中，紫外荧光成像的表现优于GFPA和RFP1荧光。尽管双染色薄切片制备需要更高的技术要求，但它是一种可靠、相对快速且经济的方法，可以扩展树木年轮学研究的范围，并支持森林管理、气候研究和生物多样性保护等更广泛的应用。

引言

森林提供了重要的生态服务，包括碳封存、生物多样性保护和气候调节（Bonan, 2008; Brockerhoff et al., 2017; Pan et al., 2024）。了解各个树种的生长方式及其对环境变化的响应对于预测森林结构、生产力、恢复力和碳循环的变化至关重要。树木年轮学作为研究树木年轮的学科，一个多世纪以来一直是森林和气候研究的基石，提供了高分辨率的生长动态和环境条件记录。然而，树木年轮学研究历来主要关注那些年轮边界明显、易于识别的物种，如针叶树或环孔材阔叶树（Zhao et al., 2019）。这种有限的关注范围导致了关于扩散孔材和半环孔材树种生长情况的重大知识空白。这些物种在温带森林中通常数量众多甚至占主导地位，在从最近受干扰的林分到成熟晚演替阶段的各个生态群落中都发挥着基础性的生态作用（Kolbek et al., 2003）。此外，木材的孔隙度是一个重要的功能特征，它影响着树木的生态学特性、生理机能、碳储存以及对气候变化和干扰的抵抗力，从而显著塑造了森林动态（Buttó et al., 2021; Fonti et al., 2010; Grover et al., 2023; Yin et al., 2023; Yuan et al., 2025）。因此，将树木年轮学研究扩展到这些研究不足的物种对于更全面地理解森林动态至关重要。这种更广泛的视角将有助于更好地预测物种组成和生长率的变化如何影响森林生产力、恢复力和碳动态。要实现这一目标，需要能够显著提高年轮可见性的方法，从而进行精确测量，并更深入地了解这些物种对森林生态系统的贡献。

传统技术，如打磨、涂白垩或用墨水使木材横截面变暗，已被广泛用于提高年轮的可见性（Fonti et al., 2010; G?rtner et al., 2015）。虽然这些方法对许多物种有效，但对于那些木材解剖结构复杂的物种来说有时可能不够理想。然而，最近在样品制备和成像技术方面的进步扩大了研究这些年轮不明显的物种的潜力。尽管大多数这些进步主要集中在热带物种上，但它们也有望应用于更广泛的领域。荧光显微镜已成为一种强大的工具，可以改善那些在传统光学显微镜下年轮不易看到的树种的年轮可见性（Godoy-Veiga et al., 2019; Lussier et al., 2004; Slotta et al., 2017）。同样，X射线密度测量法也被证明可以有效可视化热带物种的年轮，通过捕捉能突出年轮边界的密度变化（Pagotto et al., 2017）。此外，Quintilhan等人（2021）表明，将染色薄切片制备与X射线密度测量相结合可以进一步提高热带物种年轮的可见性。我们提出，全芯双染色薄切片结合荧光显微镜可以提供更好的年轮可视化效果。

本研究评估并比较了东亚和北美62种sensu lato温带树种的样品制备和成像技术，这些树种具有不同的木材结构。我们的目标是确定传统和先进的树木年轮学方法在可视化这些研究不足的温带树种年轮边界方面的有效性。测试了三种制备方法：1）使用核微切片机处理后的增量芯材；2）使用核微切片机处理后涂上白垩的增量芯材；3）双染色薄切片。然后使用可见光显微镜和带有绿色、红色及紫外滤光片的荧光显微镜对制备好的样品进行观察。

章节摘录

样品制备和成像

我们使用年轮钻从东亚和北美的62种sensu lato温带树种（包括亚种和变种）的胸高（距地面130厘米处）采集了增量芯材（表1）。采样时间分别为2006-2019年在东亚和2021-2023年在北美，主要在各种大小的永久样地内进行（面积从400平方米到10,000平方米不等）。采集的增量芯材来自这些样地内所有胸高直径≥7厘米的树木。

结果与讨论

类内相关系数（ICC(3,k) = 0.90，F(743, 2229) = 10.5，p < 0.001），表明当四位评审员的评分取平均值时，可靠性非常高，这支持了评分过程的有效性（Koo and Li, 2016）。Welch的方差分析显示样品制备和成像方法对年轮边界可见性有显著影响（F(11, 288.1) = 50.408，p < 0.001）。

根据四位独立评审员的平均评分（表2，表S1），双染色薄切片...

结论

本研究表明，双染色薄切片制备结合可见光显微镜能够在多种温带树种中提供最清晰的年轮可见性。虽然涂有白垩的增量芯材在可见光下的效果也很有价值且更容易获取，但对于木材解剖结构复杂的物种来说，双染色薄切片特别有用。尽管荧光显微镜显示出一定的潜力，但其表现并未始终优于可见光显微镜。

作者贡献声明

Grant L. Harley：撰写 – 审稿与编辑，调查。Pavel Fibich：撰写 – 审稿与编辑，监督，调查。Akira Kagawa：调查，撰写 – 审稿与编辑。Ishihara Masae Iwamoto：撰写 – 审稿与编辑，调查。Hideyuki Ida：撰写 – 审稿与编辑，调查。Kazuhiko Hoshizaki：调查，撰写 – 审稿与编辑。Mahoko Noguchi：撰写 – 审稿与编辑，调查。Masahiro Nakamura：调查，撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了捷克科学基金会的研究资助（项目编号25-15727S）和捷克科学院的长期研究发展项目（项目编号RVO 67985939）的支持。我们感谢所有参与野外工作的人员。