新型小鼠模型揭示脑源性细胞外囊泡在血液中的存在及其跨血脑屏障转运机制

研究人员针对中枢神经系统(CNS)疾病诊断中血脑屏障(BBB)阻碍脑源性生物标志物检测的难题，开发了两种新型小鼠模型：通过rAAV介导神经元特异性表达mKate2-CD63荧光标记物和脑区定向注射DiI染料。研究首次直接证实脑源性小细胞外囊泡(sEVs)可跨越BBB进入外周血液循环，为CNS疾病无创诊断提供了关键实验模型和技术基础。该成果发表于《Extracellular Vesicle》，为开发高效富集脑源性EVs(BDEs)的新方法奠定了重要基础。

　　

中枢神经系统疾病的诊断一直面临重大挑战，主要障碍在于血脑屏障严格限制了脑源性蛋白进入外周血液循环。虽然血液检测是临床最常用的诊断手段，但对阿尔茨海默病等神经退行性疾病的诊断灵敏度始终不尽如人意。近年来，科学家们将目光投向了一种直径小于200纳米的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)——这些由细胞自然释放的"分子快递"携带来源细胞的生物分子特征，理论上可以穿越血脑屏障，成为潜在的"液体活检"靶标。然而，脑源性sEVs(BDEs)是否真的存在于外周血液中？这个关键问题由于缺乏特异性标记手段而长期悬而未决。

中国脑科学与智能技术卓越创新中心（Chinese Institute for Brain Research, CIBR）的研究团队创新性地建立了两种小鼠模型来解决这一难题。研究人员首先采用重组腺相关病毒(rAAV)在野生型小鼠神经元中特异性表达mKate2-CD63融合蛋白，成功实现了神经元来源sEVs的荧光标记；同时开发了脑区定向注射脂溶性荧光染料DiI的技术，实现对特定脑区EVs的标记。通过这两种独立的方法，研究首次直接证实了BDEs确实存在于外周血液中，为开发基于BDEs的中枢神经系统疾病诊断方法提供了关键实验依据。该研究成果发表在《Extracellular Vesicle》期刊。

研究主要采用了以下关键技术：1) rAAV2/9病毒包装及脑室注射技术实现神经元特异性标记；2) 脑立体定位注射DiI进行区域特异性标记；3) 差速离心结合超速离心分离BDEs和血浆来源EVs(PDEs)；4) 纳米颗粒追踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)表征EVs；5) 流式细胞术和STED超分辨显微镜定量分析荧光标记EVs。

【小细胞外囊泡表征】部分证实，从脑组织和血浆中分离的sEVs具有典型杯状形态，直径主要分布在200nm以下，且表达ALIX、TSG101和CD63等EVs标志蛋白，符合国际细胞外囊泡学会(ISEV)的鉴定标准。

【检测mKate2-CD63标记的BDEs和PDEs】结果显示，在mKate2-CD63小鼠大脑皮层中，mKate2荧光与神经元标志物NeuN共定位，而与星形胶质细胞标志物GFAP不重合。Western blot证实mKate2-CD63仅在脑组织表达。流式检测发现约10%的BDEs和0.1%的PDEs呈现mKate2荧光信号，使用甘露醇增加BBB通透性后，PDEs中荧光标记EVs比例显著升高。

【检测DiI标记的BDEs和PDEs】通过三维重建技术证实DiI成功标记了海马和大脑皮层区域。流式分析显示约5%的BDEs和0.1%的PDEs携带DiI荧光，其中40%的DiI阳性颗粒经鉴定为EVs。STED超分辨显微镜观察到DiI信号与EV标志物共定位。

【检测DiI标记的10K组分】研究发现10,000g离心沉淀的"10K组分"中不仅含有预期的大EVs(m/lEVs)，还存在大量小颗粒。这些组分中也检测到DiI标记颗粒，证实脑源性m/lEVs同样可以跨越BBB。

在讨论部分，作者指出这项研究解决了该领域两个关键问题：首次直接证实BDEs存在于外周血液，并建立了可推广的动物模型。mKate2-CD63模型具有神经元特异性强、背景荧光低的优势，而DiI标记则具有操作简便、时效性好的特点。研究还发现增加BBB通透性可显著提高血液中BDEs的检出率，这为开发临床检测方法提供了重要启示。

该研究的创新性在于：1) 使用红色荧光蛋白mKate2替代常用的GFP，提高了检测灵敏度；2) 采用hSyn1启动子确保神经元特异性表达；3) 通过两种独立方法相互验证结果的可靠性。这些模型不仅为BDEs研究提供了重要工具，未来还可用于筛选脑细胞特异性EVs标志物，推动中枢神经系统疾病无创诊断技术的发展。

值得注意的是，研究也揭示了当前技术的局限性：mKate2-CD63不能标记所有神经元EVs，而DiI会非特异性标记脂蛋白等非EV成分。这些发现为后续方法学优化指明了方向，包括开发更高效的标记策略和更精确的分离技术。随着这些技术的不断完善，基于BDEs的液体活检有望成为神经退行性疾病早期诊断和疗效监测的有力工具。