基于新型ZISC宿主细胞去除技术的宏基因组下一代测序流程优化及其在脓毒症病原体检测中的应用

为解决脓毒症病原体检测中宿主DNA背景干扰导致的mNGS灵敏度不足问题，台北荣民总医院团队开发了基于两性离子界面超自组装涂层(ZISC)的过滤装置。该研究通过对比gDNA与cfDNA两种样本类型，证实ZISC过滤可实现>99%白细胞去除，使微生物reads提升10倍至9351 RPM，在8例血培养阳性样本中实现100%检出率，为感染性疾病诊断提供了高效技术路径。

　　

脓毒症作为威胁生命的全身炎症反应综合征，其快速准确的病原学诊断一直是临床难题。传统血培养方法需时长达数天，且灵敏度不足40%，导致近半数患者无法获得及时有效的抗生素治疗。宏基因组下一代测序(mNGS)技术虽能实现无偏倚的病原体筛查，但血液样本中高达99.9%的人类基因组背景严重挤占测序资源，使得低丰度病原体信号被淹没。

台北荣民总医院急诊科联合阳明交通大学的研究团队在《Molecular Diagnosis》发表创新性研究，开发出基于两性离子界面超自组装涂层(Zwitterionic Interface Ultra-Self-assemble Coating, ZISC)的过滤装置。该装置通过电荷相互作用选择性捕获白细胞，在保持微生物完整性的同时，将宿主DNA背景降低6个数量级，使mNGS检测灵敏度提升至150基因组当量(GE)/mL。研究证实，经ZISC处理的基因组DNA(gDNA)样本微生物reads达到9351 RPM，较未处理样本(925 RPM)提升10倍，在8例血培养阳性脓毒症病例中实现100%病原体检出率，显著优于游离DNA(cfDNA)检测方法(75-87.5%)。

关键技术方法包括：1)采用ZISC滤器处理3-13mL全血样本评估白细胞去除效率；2)使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物和猫冠状病毒评估滤器穿透性；3)对比QIAamp微生物组试剂盒和NEBNext甲基化DNA去除法的性能差异；4)对8例急诊脓毒症患者配对样本进行gDNA与cfDNA的mNGS平行检测；5)建立包含1400种病原体基因组的生物信息学分析流程。

3.1 宿主去除效率与微生物完整性验证

通过不同体积(3-13mL)全血测试显示，ZISC滤器对白细胞去除率>99%，且在10⁴ CFU/mL细菌和病毒浓度下保持>95%的微生物穿透率。如图2a所示，13mL血液处理仍维持3-log的白细胞减少，而细菌计数实验证实大肠杆菌等病原体可自由通过滤膜。

3.2 宿主去除方法比较

相较于差异裂解法和甲基化DNA去除法，ZISC过滤将人类DNA Ct值从28.5提升至33.4，微生物reads富集效果最佳（图2c）。操作时间仅需5分钟，远快于其他方法(2-4小时)，且不会造成Imtechella halotolerans等目标微生物丢失。

3.3 检测灵敏度验证

使用含21种微生物的D6331标准品测试显示，ZISC处理使100 GE/mL样本的检出率从82.4%提升至100%，最低检测限达150 GE（图2d）。在模拟临床样本中，未过滤组漏检3种低丰度微生物，而过滤组全部检出。

3.4 临床样本验证

如表1所示，8例患者中gDNA-mNGS经ZISC处理后，微生物reads从平均925 RPM跃升至9351 RPM。典型案例如患者3的肺炎克雷伯菌检出reads从645提升至7771，而cfDNA方法仅检测到1885 reads。值得注意的是，白色念珠菌等真菌在过滤组获得54倍富集，证明该方法对真核病原体同样有效。

3.5 微生物组成保真度

如图3b所示，过滤前后样本的微生物组成比例高度一致(R²=0.90)，证明ZISC处理不会引入检测偏倚。这种特性对区分致病菌与定植菌至关重要，如患者5同时检出的大肠杆菌和白色念珠菌比例保持稳定。

该研究突破性地解决了mNGS在血液检测中的关键技术瓶颈。ZISC过滤装置通过物理去除白细胞，避免了化学处理导致的微生物DNA损失，使测序资源利用率提升10倍。临床验证表明，该方法对革兰阴性菌（如肺炎克雷伯菌）、革兰阳性菌（如MRSA）和真菌均有优异检出性能，且兼容Illumina和Nanopore平台。值得注意的是，cfDNA-mNGS虽操作简便，但其1488 RPM的检测灵敏度仍显著低于过滤后的gDNA方法，证实细胞组分仍是更优的检测材料。

研究局限性在于未评估分枝杆菌等胞内病原体的过滤损失风险，且D6331标准品缺乏病毒代表株。未来需扩大病原体验证范围，并探索该技术在脑脊液等样本中的应用潜力。作为首个实现>99%白细胞去除的物理过滤方案，ZISC技术为感染性疾病的精准诊断提供了新范式，其3小时快速检测流程尤其符合脓毒症救治的黄金窗口期需求。