多重重组酶聚合酶扩增技术快速检测血培养中5种碳青霉烯酶基因和10种mcr基因的建立与应用

本研究针对碳青霉烯酶基因(blaKPC/blaNDM/blaOXA-48-like/blaIMP/blaVIM)和移动粘菌素耐药基因(mcr-1~mcr-10)的快速检测难题，开发了三重RPA检测体系，结合SYBR? Green I显色和侧流免疫层析技术，实现35-50分钟内完成检测，灵敏度达2-200 CFU/反应，为耐药基因的床旁检测提供了创新解决方案。

　　

随着全球范围内抗菌药物耐药性(AMR)危机的加剧，碳青霉烯类耐药肠杆菌(CRE)和耐粘菌素革兰阴性菌的出现给临床治疗带来严峻挑战。世界卫生组织已将碳青霉烯耐药肠杆菌和鲍曼不动杆菌列为最危险的多重耐药菌，而粘菌素作为"最后防线"抗生素的失效更使治疗选择变得极为有限。这些耐药性主要由质粒编码的碳青霉烯酶基因(bla_KPC、bla_NDM、bla_OXA-48-like、bla_IMP、bla_VIM)和移动粘菌素耐药基因(mcr-1至mcr-10)介导，且这些基因常在同一菌株中共存，导致"超级耐药"现象。传统检测方法存在耗时长、设备依赖性强等缺陷，难以满足临床快速诊断需求。

针对这一重大临床需求，泰国玛希隆大学医学技术学院的研究团队在《International Journal of Antimicrobial Agents》发表重要研究成果。研究人员创新性地建立了三重重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系，首次实现了5种碳青霉烯酶基因和10种mcr基因的同步快速检测。该研究通过优化引物设计、反应条件和检测方法，开发了可与SYBR? Green I显色和侧流免疫层析(LFIA)技术联用的检测方案。关键技术包括：1)采用生物信息学工具设计覆盖所有基因变体的多重RPA引物；2)建立直接从阳性血培养瓶中提取DNA的改良煮沸法；3)开发可同时检测bla_NDM/bla_OXA-48-like和mcr-1/mcr-3的双标记LFIA系统。

研究结果显示：在引物设计方面，通过严格的ΔG值(-9.0 kcal/mol)筛选和3'端错配分析，成功设计了15对RPA引物，可覆盖所有mcr基因和主要碳青霉烯酶基因变体。特异性验证表明，三重RPA体系对bla_NDM/bla_OXA-48-like和mcr-1/mcr-3的检测无交叉反应。灵敏度测试显示，RPA-SYBR? Green I对大多数基因的检测限达2×10⁰-2×10² CFU/反应，而RPA-LFIA对bla_NDM/bla_OXA-48-like/mcr-1的检测限为2×10³ CFU/反应。在临床样本验证中，该体系成功从模拟阳性血培养瓶(含7 CFU/mL初始接种量)中检出所有目标基因，与PCR结果完全一致，全过程仅需50分钟。

研究结论部分强调，这是首个能同时检测全部5种主要碳青霉烯酶基因和10种mcr基因的多重RPA系统。相比商业化的检测平台(如BioFire? BCID2)，该方案具有三大优势：1)检测基因谱更广，特别是对mcr-2至mcr-10的覆盖；2)成本显著降低，每靶点检测成本仅0.4-1.725美元；3)设备需求简单，仅需普通恒温设备和离心机。研究者特别指出，15分钟的反应时间设定有效避免了非特异性扩增，而25μL的微型化反应体系使检测成本降低50%。该技术为资源有限地区的AMR监测提供了实用工具，对指导临床合理使用碳青霉烯类和粘菌素类抗生素具有重要意义。未来通过整合CRISPR/Cas系统，有望进一步提升检测灵敏度，为耐药菌感染的精准诊疗提供新范式。