超嗜热古菌Pyrococcus furiosus耐热dUTPase P45的结构功能解析及其增强PCR效率的分子机制

本研究针对PCR扩增中存在的效率低、产物量少等问题，聚焦Pyrococcus furiosus来源的耐热dUTPase P45，通过2.1-2.2?高分辨率晶体结构解析，揭示其通过保守催化核心（W93/D95/T103/Y138）水解dUTP维持基因组完整性的分子机制。研究发现P45以同源三聚体形式存在，底物结合诱导β-折叠构象重排，显著提升Pfu/KOD聚合酶的20kb长片段扩增效率，为高保真DNA扩增系统提供新型工具酶。

　　

在分子生物学领域，聚合酶链式反应（PCR）技术虽已广泛应用，但仍面临扩增效率低、长片段产量不足等技术瓶颈。尤其在高灵敏度诊断或测序应用中，由dUTP误掺引发的假阳性风险更成为关键制约因素。传统解决方案多依赖被动添加剂如DMSO，而针对dUTP/dTTP代谢调控的主动干预策略尚缺乏结构基础。

中国科学院研究人员在《International Journal of Biological Macromolecules》发表的研究，首次解析了超嗜热古菌Pyrococcus furiosus来源的dUTPase P45的晶体结构。通过X射线晶体学（2.1? apo结构/2.2? dUMP复合物结构）结合点突变实验，发现该酶通过保守的W93-D95-T103-Y138催化网络水解dUTP，其同源三聚体构象在底物结合时发生β-折叠重构。研究采用Pfu/KOD聚合酶体系验证，证实P45可使20kb长片段扩增效率提升3倍以上。

【P45 enhances the PCR amplification and production】

对比实验显示，添加P45的Pfu聚合酶对5-20kb片段扩增效率显著提升，电泳检测证实产物量增加2.5倍。热稳定性分析表明80℃处理30分钟后仍保留90%活性。

【Expression and purification of WT and mutated P45】

通过pET-28a载体在E. coli BL21(DE3)中表达6×His标签蛋白，16℃低温诱导获得可溶性蛋白。凝胶过滤层析证实天然状态为三聚体，突变体W93A完全丧失水解活性。

【Discussion】

结构比对揭示P45与病毒、真核生物dUTPase的催化核心具有高度保守性。底物诱导的"活性位点闭合"构象变化是其热稳定性的结构基础。该发现不仅阐明古菌dUTPase的进化保守性，更为设计抗尿嘧啶污染的高保真PCR体系提供新思路。

这项研究首次从原子水平揭示耐热dUTPase的构效关系，其开发的P45添加剂可有效解决长片段扩增中的"聚合酶制动"问题。相较于传统添加剂，这种基于代谢调控的主动策略在ctDNA检测、古DNA重建等场景具有独特优势。研究建立的"结构-功能"关联模型，为后续开发更高效的PCR增强剂奠定了理论基础。