基于UHPLC-ESI-MS/MS技术的植物组织中ACC非衍生化定量分析方法开发及其在果实成熟调控研究中的应用

本研究针对植物激素乙烯直接前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)检测中存在的衍生化步骤复杂、基质干扰严重等问题，开发了基于乙酸盐液液微萃取(LLME)纯化和超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-ESI-MS/MS)的定量方法。该方法灵敏度达2.5 pg，回收率95.82%，成功应用于10 mg微量果实样本检测，为研究ACC在植物生长发育和环境响应中的双重功能提供了关键技术支撑。

　　

在植物生长发育和环境适应过程中，乙烯作为唯一的气态植物激素发挥着关键调控作用。然而，乙烯检测面临重大挑战——它不仅会被机械损伤诱导产生，其分子量(28 Da)还与空气中的氮气相同，导致气相色谱检测时易受干扰。更复杂的是，近年研究发现乙烯合成的直接前体ACC可能具有独立于乙烯的信号功能，这使准确量化ACC成为揭示植物生命活动调控机制的关键突破口。

湖南农业大学生物科学技术学院植物激素与生长发育湖南省重点实验室的研究团队在《BMC Plant Biology》发表的研究中，创新性地建立了无需衍生化的ACC定量分析方法。通过优化乙酸盐液液微萃取纯化流程，结合高精度六通阀控制流动相进入质谱的时机，显著降低了基质干扰，使检测限达到2.5 pg，较既往方法提升10-1000倍。该方法在10 mg微量植物样本中成功量化了苹果、香蕉等9种果实的ACC含量，为解析ACC在果实成熟和环境响应中的双重功能提供了可靠工具。

关键技术方法包括：1)采用乙酸盐绿色溶剂进行液液微萃取纯化；2)以氘代同位素[²H₄]ACC为内标；3)通过六通阀精确控制UHPLC流动相进入ESI离子源的时间窗口；4)优化碰撞能量(-30 eV)捕获[²H₄]ACC特征碎片离子(m/z 32.1)。

结果

提取溶剂优化

比较氯仿、正己烷、乙酸乙酯和石油醚等溶剂的提取效率，发现乙酸乙酯在室温下振荡1分钟即可实现99.42%提取率，且毒性最低。

色谱条件优化

选用Universil AQ-C₁₈色谱柱(2.1×150 mm, 1.8 μm)，以0.05%乙酸水溶液/乙腈为流动相，在10%乙腈等度洗脱3分钟后梯度升至90%，有效分离ACC与干扰物。

质谱参数优化

确定ACC特征离子对为m/z 102.15/56.05(定量离子)和102.15/28.1(定性离子)，[²H₄]ACC选择m/z 106.2/32.1作为定量离子以避免样品基质干扰。

方法验证

在0.5-1500 ng·mL^-1范围内线性良好(R²=0.9998)，基质效应仅7.4%，日内精密度RSD为3.54%，显著优于既往方法。

果实ACC检测

苹果ACC含量最高(约2000 ng·g^-1)，樱桃番茄次之(700 ng·g^-1)，梨最低(60 ng·g^-1)，证实方法适用于不同类型果实。

结论与意义

该研究建立的ACC定量方法具有三大突破：1)首次实现10 mg微量植物样本的非衍生化检测；2)通过LLME纯化和流动相精确控制，将基质效应降至7.4%；3)发现[²H₄]ACC特征离子m/z 106.2/32.1可避免丝氨酸干扰。这些创新为解析ACC在乙烯合成途径之外的独立功能（如细胞壁信号传导、气孔发育等）提供了关键技术支撑，对提高农作物抗逆性和果实品质调控具有重要应用价值。