蓝莓‘蓝带’品种高效离体再生体系的建立：灭菌、愈伤组织形成及芽器官发生的优化策略

《Discover Plants》：In vitro protocol for sterilization, callogenesis and shoot organogenesis for blueberry (Vaccinium corymbosum L.) var. ‘Blue ribbon’

本研究针对蓝莓传统繁殖方法效率低、周期长等问题，开展了‘蓝带’高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）离体再生技术优化研究。通过系统筛选表面灭菌剂、植物生长调节剂（PGRs）组合，确立了以4% NaOCl (4 min)联合0.1% HgCl2(2 min)的高效灭菌方案，显著降低污染率至19.97%。在Woody Plant Medium (WPM)基础上，优化出4 mg/L BAP与0.75 mg/L NAA组合可高效诱导愈伤组织（诱导率97.96%）；6 mg/L BAP或6 mg/L TDZ能有效促进不定芽分化（每外植体芽数分别为4.66±0.58和4.33±0.58）。该研究为蓝莓种质资源快繁、遗传改良及产业化生产提供了可靠技术支撑。

　　

蓝莓，这种属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）的温带水果，不仅风味迷人，更因其富含抗氧化和抗炎成分而备受关注。然而，这种具有重要经济价值和营养价值的作物，其育种和繁殖却长期受限于传统方法。蓝莓植株在定植初期生长缓慢，从新植株成熟到开始结果需要很长时间。常规上，蓝莓通常通过种子或硬枝扦插进行繁殖。但种子存在休眠期长、活力低且杂合度高的问题；而扦插则因对湿度、温度等特定生根条件要求苛刻，存在生根困难、成活率低的挑战。此外，田间种植的品种可能表现出高度的遗传变异性，使得通过繁殖保持性状一致性变得困难。这些瓶颈严重制约了蓝莓产业的快速发展。因此，开发高效、快速的繁殖技术显得尤为重要。离体繁殖（In vitro propagation）技术，即植物组织培养（Plant tissue culture），为蓝莓的快速无性系繁殖提供了充满希望的解决方案。它能够实现蓝莓植物的快速克隆增殖，降低劳动力成本，并通过在无菌可控环境中进行严格灭菌程序，提供无病种植材料，同时保持遗传纯度，不受季节和环境限制。

为了应对上述挑战，研究人员以高丛蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）品种‘蓝带’（‘Blue ribbon’）为研究对象，开展了一项旨在建立高效离体灭菌、愈伤组织形成（callogenesis）和芽器官发生（shoot organogenesis） protocols（方案）的系统研究。该研究论文发表在《Discover Plants》上，为蓝莓的微繁殖（micropropagation）技术优化提供了重要依据。

为开展本研究，研究人员运用了几个关键技术方法。研究材料来自国内某大学学院保存的盆栽母株。关键技术包括：（1）外植体（explant）的采集与预处理：从6月龄母株上获取节段和腋芽，并进行杀菌剂预处理。（2）表面灭菌方案优化：系统测试了不同浓度及组合的氯化汞（HgCl₂）和次氯酸钠（NaOCl）作为表面消毒剂的效果。（3）离体培养体系建立：以木本植物培养基（Woody Plant Medium, WPM）为基础培养基，分别添加不同种类和浓度的植物生长调节剂（Plant Growth Regulators, PGRs），包括细胞分裂素（cytokinin）如6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine, BAP）、玉米素（Zeatin, ZEA）、噻苯隆（Thidiazuron, TDZ）以及生长素（auxin）如萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid, NAA），用于诱导愈伤组织和促进芽器官发生。（4）统计分析：实验采用完全随机设计（Completely Randomized Design, CRD），数据使用专业软件进行分析。

外植体对灭菌剂的反应

研究人员测试了多种表面灭菌剂及其组合。结果表明，灭菌剂的类型、浓度和暴露时间显著影响微生物污染率、外植体死亡率和存活率。最有效的灭菌处理是先用4% NaOCl处理4分钟，再用0.1% HgCl₂处理2分钟（记为ST₇）。该处理将微生物污染率降低至19.97%，外植体存活率达到39.98%，死亡率控制在39.95%。单独使用NaOCl或HgCl₂的效果均不如两者组合使用。研究指出，NaOCl因其强氧化性可破坏微生物蛋白质和核酸，而HgCl₂则通过氧化肽键使微生物蛋白质变性。前期使用杀菌剂Carbendazim进行预处理也有助于减少污染。因此，ST₇被确定为蓝莓外植体最适宜的灭菌方法。

外植体离体愈伤组织的形成

研究探讨了不同浓度BAP和NAA组合对蓝莓节段外植体愈伤组织诱导的影响。结果显示，未添加任何植物生长调节剂的对照处理（WPM₀）愈伤组织诱导时间最长（22.00±0.96天），诱导率最低（27.14%）。添加植物生长调节剂后，愈伤组织诱导效果显著改善。其中，含有4 mg/L BAP和0.75 mg/L NAA（或1 mg/L NAA）的WPM培养基表现最佳，能显著缩短愈伤组织形成时间至约5.33±2.08天，并将诱导率大幅提高至97.96%。研究表明，BAP和NAA的组合产生了协同效应，通过增强细胞分裂和去分化过程，为愈伤组织诱导创造了最佳的激素平衡。细胞分裂素浓度的增加有助于弥补腋芽等部位内源细胞分裂素水平的不足。

外植体离体芽器官发生

研究评估了三种细胞分裂素（BAP, ZEA, TDZ）在不同浓度（2, 4, 6 mg/L）下对芽诱导的影响。在芽启动时间方面，对照处理（无PGRs）需要28.66±2.52天，而6 mg/L BAP处理仅需13.00±1.73天，效果最优。增加ZEA和TDZ的浓度也能减少芽启动所需天数。在芽诱导率方面，对照最低（43.93%），6 mg/L BAP处理最高（81.39%）。在每外植体芽数方面，对照产生1.66±0.58个芽，而6 mg/L BAP和6 mg/L TDZ处理能显著促进芽增殖，分别达到4.66±0.58和4.33±0.58个芽。研究指出，BAP在较高浓度下能与其他培养基成分产生协同效应，进一步促进芽的发育。虽然TDZ在低浓度下可能比BAP更有效，但BAP因其成本较低且易于获取，是降低蓝莓离体克隆繁殖生产成本的良好选择。ZEA由于其游离形式在培养基中消耗较快，效果随时间减弱，而玉米素核苷（zeatin riboside）等结合形式效果更佳。

研究结论与意义

本研究成功建立了蓝莓‘蓝带’品种高效离体再生体系的关键技术参数。在灭菌方面，推荐使用4% NaOCl (4 min) 后接0.1% HgCl₂(2 min) 的组合方案，能有效控制污染并保证外植体存活。在愈伤组织诱导方面，WPM培养基中添加4 mg/L BAP和0.75 mg/L NAA是最佳组合，能实现快速高效的愈伤组织诱导。在芽器官发生方面，6 mg/L BAP对于快速启动芽发生和获得高芽诱导率最为有效，而6 mg/L BAP和6 mg/L TDZ均能促进每外植体产生最多数量的不定芽。

该研究的成功具有重要意义。首先，它提供了一套标准化、可重复的离体繁殖方案，能够实现蓝莓的快速、大规模克隆繁殖，克服传统繁殖方法的局限性。其次，通过优化植物生长调节剂的使用，显著提高了繁殖效率和一致性，有利于保持优良品种的遗传特性。第三，获得的离体植株具有童期短、生根能力强等特点，有助于加速性状评价和育种进程。最后，该技术体系为蓝莓种质资源的保存、创新及商业化生产提供了强有力的技术支撑，对推动蓝莓产业发展具有积极影响。这项研究为其他难繁殖的木本果树作物的离体再生技术开发提供了有益参考。