单链Fab链交换技术(scFab-PACE)实现肿瘤细胞靶向性T细胞衔接器的精准激活

推荐：为解决T细胞双特异性抗体(TCBs)因缺乏真正肿瘤特异性靶点导致的治疗窗口狭窄问题，罗氏研究人员开发了第二代Prodrug-Activating Chain Exchange (PACE)技术。通过将条件性效应域整合至单链Fab(scFab)并引入柔性连接肽，显著降低外周非特异性激活风险。该研究证实scFab-PACE前药可在HER2阳性肿瘤细胞表面实现抗原密度依赖的CD3结合功能激活，并能同时条件性激活CD3/CD28双信号通路，为扩大TCBs治疗指数提供新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，T细胞双特异性抗体(TCBs)虽展现出显著临床潜力，却始终面临两大困境：一是缺乏真正肿瘤特异性靶点导致"脱靶毒性"，二是持续激活外周T细胞引发细胞因子释放综合征(CRS)。传统解决方案依赖肿瘤微环境触发条件性激活，但蛋白酶、pH值或ATP等环境因素在正常组织与肿瘤间的差异往往不够显著。罗氏制药(Roche)的研究团队在前期研究中开发的Prodrug-Activating Chain Exchange (PACE)技术虽能实现肿瘤特异性激活，却因TriFab结构缺失FcRn结合域导致半衰期短，且存在溶液中的自发链交换问题。

研究人员通过将链交换模块整合至Fab区域，开发出含完整Fc结构域的第二代Fab-PACE系统。关键技术包括：1)采用Knob-into-Hole技术构建异二聚体Fc；2)在效应Fab的可变区框架引入排斥电荷突变(Q39E/Q38E与Q39K/Q38K)；3)通过6xG4S-8xG4S柔性连接肽构建单链Fab(scFab)；4)使用Jurkat NFAT-RE报告细胞和PBMC杀伤实验验证功能；5)通过SEC和质谱光度法分析链交换效率。

研究结果部分显示：
Fab-PACE概念设计：将第一代TriFab-PACE的CH3区链交换转变为Fab区链交换，保留完整Fc结构域(P329G LALA突变消除FcγR结合)，通过VH/VL界面电荷排斥驱动靶细胞表面特异性重组。

scFab-PACE显著提升激活窗口：相比无连接肽的Fab-PACE(100nM时35%溶液链交换)，scFab-PACE在同等条件下仅2%自发激活。7xG4S连接肽在保持肿瘤细胞表面高效激活的同时，将非特异性激活降低100倍。

抗原密度依赖性激活：在HER2高表达细胞(SK-BR-3：5×10⁵/cell)中EC₅₀达亚纳摩尔级，而HER2低表达细胞(MCF-7：1×10⁴/cell)无响应，证实激活阈值介于2.2×10⁴-9.6×10⁴抗原/cell。

双功能协同激活：通过将CD28结合域整合至dummy链，实现在HER2阳性细胞上同时激活CD3(信号1)和CD28(信号2)，其中CD3在内侧、CD28在外侧的构型显示出最佳共刺激效果。

该研究突破性地解决了条件性TCBs开发中的药代动力学和特异性难题。scFab连接肽的引入使溶液相链交换降至可忽略水平，而完整Fc结构则保障了药物半衰期。更值得注意的是，这种模块化设计允许在一个分子中整合多重条件性功能，如同时实现T细胞激活和共刺激，或结合检查点阻断功能。该技术为拓展TCBs靶向空间提供了新思路，特别是针对那些在正常组织有基础表达、传统TCBs无法安全靶向的肿瘤相关抗原。研究结果发表于《Journal of Biomedical Informatics》，为下一代肿瘤免疫治疗药物的开发奠定了重要技术基础。