微波与超声辅助提取结合HPLC-UV技术用于人血浆中法匹拉韦的干血斑快速检测及稳定性研究

本研究针对传统血浆样品前处理过程中有机溶剂消耗大、步骤繁琐等问题，开发了基于干血浆斑(DPS)的微波辅助提取(MAE)和超声辅助提取(UAE)两种微型化方法，结合高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)实现了法匹拉韦(FAV)的高通量检测。研究人员通过优化提取条件使回收率达87-103%，证实两种方法均符合ICH M10指南要求，且UAE在绿色度评估中表现更优。该研究为抗病毒药物监测提供了10 μL超微量样本分析方案，显著提升了临床药代动力学研究的效率。

　　

在COVID-19大流行期间，抗病毒药物法匹拉韦(FAV)因其广谱抗RNA病毒特性成为研究热点。然而传统血浆药物分析方法面临严峻挑战：常规蛋白质沉淀(PP)方法需消耗3-5倍血浆体积的有机溶剂，样本处理步骤繁琐，且无法避免样品稀释效应。更棘手的是，FAV在生物样本中的稳定性数据缺乏，这对临床药代动力学研究和治疗药物监测造成显著障碍。

针对这些技术瓶颈，来自埃及Al-Andalos制药公司合作团队的研究人员创新性地将干血浆斑(DPS)技术与现代提取技术相结合，在《Journal of Chromatography A》发表了比较微波辅助提取(MAE)和超声辅助提取(UAE)性能的研究。该研究通过微型化设计将样本和溶剂用量降至10 μL级别，同时引入创新的"原位蛋白质变性"技术——即在干燥的血浆斑上直接加入10 μL甲醇(MAE)或乙醇(UAE)实现蛋白质瞬时变性，有效解决了传统方法中样本体积大、有机废液多等核心问题。

研究采用HPLC-UV作为检测手段，关键技术创新点包括：1) 建立DPS样本制备流程，实现血浆样本室温稳定保存；2) 优化MAE参数(50%功率，40秒)和UAE条件(40分钟)；3) 开发基于移动相的双重溶剂系统，同步完成蛋白质变性和目标物提取；4) 采用ICH M10指南进行系统验证；5) 应用AGREEprep等工具进行绿色化学评估。样本来源于服用Pirafavi?的志愿者血浆，通过 incurred sample reanalysis (ISR)验证方法可靠性。

结果与讨论部分揭示重要发现：

• 方法学验证：两种方法在10-50 μg mL^-1范围内线性良好，LLOQ达10 μg mL^-1。MAE回收率87-99%，UAE达93-103%，且基质效应均<15%。
• 稳定性研究：DPS样本在冷冻和冷藏条件下稳定性优异，30天内检测差异<13%，远超常规液体血浆样本。
• 绿色度比较：UAE在AGREEprep评估中得分0.62，显著优于MAE(0.51)，主要体现在能耗和溶剂毒性指标。
• 实际样本检测：成功应用于30例COVID-19患者血浆，ISR符合率>90%，证实方法可靠性。

结论部分强调，这项研究首次系统比较了MAE与UAE在DPS前处理中的性能差异。UAE虽耗时较长，但其卓越的绿色度指标和更高的提取效率，使其成为临床大规模研究的优选方案。特别值得注意的是，建立的DPS稳定化策略为生物样本库建设提供了新思路——干燥样本可在常规冰箱中稳定保存，极大降低了样本运输和储存成本。该方法将传统血浆分析所需的3 mL样本量锐减至10 μL，有机溶剂用量从毫升级降至210 μL，实现了"绿色化学"与"微型化分析"的双重突破，为抗病毒药物的治疗监测和临床药代动力学研究建立了新标准。