基于EGFP纯化与线性化技术的杆状病毒bacmid新型构建方法

研究人员通过引入Bsu36i酶切位点标记的egfp基因，开发了一种利用EGFP报告基因纯化结合Bsu36i线性化技术构建杆状病毒bacmid的新方法。该方法通过11.6 kbp中间载体三轮纯化获得重组体，经酶切后与8.6 kbp目标片段共转染实现高效同源重组，显著提高重组效率，特别适用于低滴度病毒的bacmid构建。

　　

杆状病毒bacmid作为外源基因表达和基因敲除的重要工具，传统构建方法依赖8.6 kbp细菌DNA片段通过同源重组或体外克隆插入病毒基因组。这项研究创新性地在细菌DNA片段中引入带有Bsu36i酶切位点的绿色荧光蛋白(egfp)标记，构建出11.6 kbp的新型中间bacmid载体。

利用EGFP报告基因的荧光特性，研究团队在培养细胞中进行了三轮高效纯化，显著提升了重组体的筛选效率。纯化后的病毒DNA转化DH10B感受态细胞，成功获得含11.6 kbp片段的中间bacmid。随后通过Bsu36i酶切实现载体线性化，与PCR扩增的8.6 kbp目标片段共转染家蚕卵巢细胞(BmN)，借助细胞内的同源重组机制完成最终组装。

该方法巧妙结合了荧光标记纯化和限制性酶切线性化两大技术优势，不仅大幅提高重组效率，更突破了传统方法对病毒滴度的依赖，为各类杆状病毒bacmid的构建提供了普适性解决方案。特别是对那些难以获得高滴度病毒的毒株，这项技术展现出独特的应用价值。