基于干研磨-单相萃取联用技术的脑组织代谢组学预处理方法优化研究

为解决脑组织代谢组学研究中样本预处理方法不统一、代谢物覆盖不全的问题，研究人员系统评估了4种匀浆技术和3种萃取方案，发现干研磨结合单相萃取法（IPA:H2O/ACN:MeOH:H2O）能显著提升UHPLC-HRMS检测的代谢物覆盖率（p<0.05）和重现性（CV<10%），为神经疾病机制和药物研究提供标准化方案。

　　

大脑作为人体最复杂的器官，其代谢网络如同精密运转的化学工厂，数以千计的小分子代谢物（分子量<1000 Da）参与调控神经信号传递、能量代谢等关键生理过程。然而，脑组织的"豆腐样"质地给代谢组学研究带来独特挑战——传统匀浆方法易导致代谢物降解，而常用萃取溶剂如氯仿（CHCl₃）和二氯甲烷（CH₂Cl₂）不仅毒性高，还会因中间层沉淀物干扰检测结果。更棘手的是，现有方法多基于肝脏样本开发，对富含脂质的脑组织适用性存疑，这导致神经退行性疾病、药物成瘾等研究领域长期缺乏标准化的样本前处理方案。

山西医科大学的研究团队在《Journal of Neuroscience Methods》发表的研究中，首次系统比较了四种匀浆技术（干研磨、湿研磨、超声破碎、珠击破碎）和三种萃取方案（单相ACN:MeOH:H₂O、两步法IPA:H₂O+ACN:MeOH:H₂O、双相MeOH:H₂O:MTBE）的组合效果。研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS），通过BEH Amide亲水柱和C₁₈反相柱实现极性/非极性代谢物的梯度洗脱分离，以特征峰数量、峰面积变异系数（CV）和绝对峰面积作为评价指标。

【主要技术方法】

实验选用3只雄性SD大鼠脑组织，液氮速冻后分别进行四种匀浆处理。萃取阶段比较了不同溶剂体系对代谢物的提取效率，最终通过正负离子模式下的HRMS检测，结合XCMS软件进行特征峰提取和统计分析。

【结果】

• 干研磨法检出特征峰数量（4583个）显著高于其他方法（p<0.05），且峰面积CV<10%的代谢物占比达78%，证明其兼具高灵敏度和重现性。

• 单相萃取法的酪氨酸（tyrosine）检出量比两步法高32%（p=0.013），且避免了双相萃取中MTBE导致的脂质损失。

• 组合方案在神经递质（如γ-氨基丁酸GABA）和鞘磷脂类物质的检测中表现突出，填补了传统方法对极性-非极性共提取的技术空白。

【结论与意义】

该研究建立的"干研磨-单相萃取"工作流程，解决了脑组织代谢组学的两大痛点：一是通过低温研磨和快速溶剂淬灭，将样本预处理时间缩短至15分钟内，有效防止了代谢物降解；二是创新性地采用IPA:H₂O/ACN:MeOH:H₂O分步萃取策略，同步实现了极性代谢物（如谷氨酸）和非极性代谢物（如花生四烯酸）的高效提取。这种方法不仅适用于基础神经科学研究，也为阿尔茨海默病等脑疾病的生物标志物筛查提供了标准化技术支撑。研究团队特别指出，该方法在检测药物成戒断相关的小分子代谢物（如多巴胺代谢产物）时灵敏度提升显著，这对禁毒领域的法医毒理学分析具有重要应用价值。