Trichoderma harzianum 菌株 AKH-5 可增强 Cajanus cajan (L.) millsp. 对 Fusarium oxysporum f. sp. udum 的抗性反应，并促进植物生长

《The Microbe》：Trichoderma harzianum isolate AKH-5 enhances defense response in Cajanus cajan (L.) millsp. against Fusarium oxysporum f. sp. udum and promotes plant growth

AKH-5作为Trichoderma harzianum的菌株，通过分泌IAA、siderophores、ACC deaminase等代谢产物及多种酶（如amylase、cellulase等），显著抑制Fusarium oxysporum f. sp. udum（体外抑制率91.73%），提高 pigeon pea种子发芽率（93.21%）和植株健壮度，降低病害严重性至31.24%。验证了其作为多功能生物接种剂在绿色农业中的应用潜力。

　　本研究聚焦于一种名为AKH-5的*Trichoderma harzianum*菌株，探讨其在促进植物生长和生物防治方面的作用，特别是针对引起 pigeon pea（豆科植物）萎蔫病的*Fusarium oxysporum* f. sp. *udum*。通过一系列实验，包括体外拮抗活性测试、扫描电镜（SEM）分析、化学成分鉴定（如GC-MS和FTIR分析）、生物活性评估（如植物激素的产生、酶活性测试）以及温室试验，研究结果揭示了AKH-5在抑制病原菌生长、提升植物健康及促进作物生长方面的多重功能。这些发现为可持续农业提供了新的思路，表明AKH-5可作为多功能生物菌剂，用于提高作物产量并控制土壤传播病害。

### 1. 研究背景与意义

pigeon pea是一种重要的豆科作物，广泛种植于热带和亚热带地区，对粮食安全和药用价值具有重要意义。然而，该作物易受多种土壤传播病原菌的侵害，其中*Fusarium oxysporum* f. sp. *udum*是导致其萎蔫病的主要病原体。这种病原菌通过侵染植物的木质部导管，阻碍水分和养分运输，从而引发严重的植物病害。此外，该病原菌具有隐蔽的生活方式，能够通过形成厚壁孢子长期存活，并产生如三萜烯类和黄曲霉毒素等有毒的次生代谢产物，进一步威胁作物产量和食品安全。

在当前的农业实践中，化学控制手段虽然有效，但可能带来生态和健康风险。因此，利用有益微生物如*Trichoderma*属进行生物防治成为一种可持续的替代方案。*Trichoderma*属真菌以其多种抗病机制著称，包括菌丝寄生、抗菌物质合成、酶分泌（如几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶）以及促进植物生长的特性。这些真菌不仅能够直接抑制病原菌的生长，还能通过激活植物的系统抗性，增强植物对后续感染的防御能力。此外，它们通过合成植物激素（如脱落酸、赤霉素、水杨酸和生长素）来提高植物的抗逆性和活力，同时还能通过铁载体介导的铁吸收、磷溶解、氰化氢和氨的产生，以及1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶的活性，促进土壤健康和作物生长。

尽管*Trichoderma*属在多种作物中已被广泛研究，但其在控制*pigeon pea*萎蔫病方面的应用仍相对较少。因此，本研究重点评估了AKH-5菌株的生物防治潜力，探索其在可持续农业中的应用前景。

### 2. 研究方法与实验设计

#### 2.1 菌株的获取与鉴定

AKH-5菌株是从土壤中分离得到的，并通过GenBank数据库进行了鉴定（编号为MK474478）。*Fusarium oxysporum* f. sp. *udum*作为病原菌，由印度农业科学大学提供，并在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养。所有化学试剂均为分析级，来源于HiMedia实验室。

#### 2.2 体外拮抗活性与菌丝寄生作用

采用双培养法评估AKH-5对*F. oxysporum* f. sp. *udum*的拮抗活性。将AKH-5和病原菌的5mm菌块分别放置在PDA平板的相对位置，置于28℃下培养4天，观察是否形成透明区。通过扫描电镜进一步验证菌丝寄生现象，结果显示AKH-5能够缠绕并破坏病原菌的菌丝结构，造成菌丝变形和断裂。

#### 2.3 挥发性有机化合物（VOCs）的提取与分析

AKH-5菌株在1L Erlenmeyer烧瓶中培养于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB，pH 5.1±0.2）中，培养7-10天后，用甲醇（1:1体积比）提取细胞外的VOCs，并在旋转蒸发仪中浓缩至40℃。提取物重新溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并在-4℃保存以备后续实验使用。

#### 2.4 双平板法评估VOCs的抗真菌活性

通过双平板法评估AKH-5产生的VOCs对*F. oxysporum* f. sp. *udum*的抑制效果。将AKH-5菌块置于PDA平板上，同时将病原菌菌块置于另一平板上，两者之间通过倒置培养，使VOCs扩散至病原菌培养皿中。结果显示，AKH-5的VOCs能够显著抑制病原菌的菌丝生长，其抑制率为36.12±2.41%。

#### 2.5 AKH-5甲醇提取物的化学成分分析

通过FTIR光谱分析，AKH-5的甲醇提取物显示出12个不同的吸收峰，表明其分子组成中含有多种功能基团。这些基团可能通过破坏病原菌细胞膜、干扰蛋白质功能和代谢过程，发挥抗真菌活性。特别值得注意的是，甲醇提取物中检测到羟基化合物和羧酸类物质，这些物质有助于离子螯合和穿透真菌细胞壁，从而有效抑制*F. oxysporum*的生长。

通过GC-MS分析，AKH-5的甲醇提取物中鉴定出13种生物活性化合物，其中一些如环状八原子硫、1-十七烷醇和1-三十三烷醇等，已被证实具有抗真菌和促进植物生长的特性。这些化合物可能通过破坏病原菌的细胞结构或激活植物的防御反应，从而实现对病原菌的控制。

#### 2.6 AKH-5的生物活性评估

进一步评估了AKH-5的多种生物活性，包括其对病原菌的毒理效应、植物激素的产生、以及酶活性。通过种子琼脂法和琼脂扩散法，发现甲醇提取物对*F. oxysporum* f. sp. *udum*的菌丝生长具有显著的抑制作用，抑制率分别为91.73%、85.33%、72.12%和51.26%。这表明AKH-5的次生代谢产物可能通过多种机制（如菌丝寄生、酶降解、竞争性排除）抑制病原菌的生长。

在植物激素方面，AKH-5能够产生20.04±0.72 μg/mL的生长素（IAA），促进根系发育。此外，AKH-5还能合成铁载体，提高铁的可利用性；通过磷溶解实验，其溶磷能力达到4.1±0.52 mg/mL，有助于植物对磷的吸收。同时，该菌株还能产生氰化氢（HCN）和氨，促进植物的抗病能力和氮素利用。ACC脱氨酶的活性进一步表明AKH-5能够缓解植物的非生物胁迫，增强其整体抗逆性。

#### 2.7 AKH-5的酶活性评估

通过酶活性实验，AKH-5被证实能够分泌多种细胞外酶，包括淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化氢酶和明胶酶。这些酶通过降解病原菌的细胞壁，有助于抑制其生长，同时还能促进土壤有机质的分解，提高养分循环效率。例如，淀粉酶活性通过碘染色法验证，显示清晰的降解区域；纤维素酶活性则通过刚果红染色和去染色后观察到的橙色或清晰区域确认。这些酶的活性为AKH-5的生物防治功能提供了重要依据。

#### 2.8 病原菌的致病性与AKH-5的超敏反应测试

为了验证AKH-5对pigeon pea的非致病性，进行了超敏反应实验。将AKH-5菌株接种于pigeon pea叶片后，未观察到任何坏死或褪绿反应，表明其不会对宿主植物造成伤害。此外，通过培养病原菌并将其孢子悬浮液喷洒在pigeon pea叶片上，观察到典型的萎蔫病症状，包括菌丝形成、叶片发黄和脱落，表明该病原菌具有较强的致病能力。

#### 2.9 AKH-5生物制剂的制备与评估

为了提高AKH-5的稳定性，研究团队采用滑石粉作为载体，通过冷冻干燥（lyophilization）技术制备了生物制剂。实验结果显示，该制剂在6个月内保持较高的孢子活性，并显著提高种子发芽率和活力指数。通过温室试验，发现AKH-5制剂能够有效抑制病原菌的侵染，降低病害严重度，同时促进植物的生长和叶片的健康。

### 3. 实验结果

#### 3.1 抗真菌活性初筛

AKH-5在双培养实验中对*F. oxysporum* f. sp. *udum*表现出64.40%的菌丝抑制作用。通过扫描电镜观察，发现AKH-5能够直接缠绕并破坏病原菌的菌丝，导致其形态发生明显改变，如扁平化、断裂和细胞内成分泄漏，表明其具有显著的拮抗能力。

#### 3.2 VOCs的提取与分析

AKH-5的VOCs提取物在双平板实验中显示出对病原菌的显著抑制作用，抑制率为36.12±2.41%。GC-MS分析表明，该菌株产生的VOCs主要由碳氢化合物、脂肪醇酯和其它化合物组成，其中环状八原子硫（S?）和生长促进剂如1-十七烷醇和1-三十三烷醇具有明显的抗真菌效果。

#### 3.3 甲醇提取物的化学成分分析

FTIR光谱分析揭示了AKH-5甲醇提取物中包含多种功能基团，如羟基、羧基和氨基，这些基团可能通过干扰病原菌的细胞膜结构和代谢途径，发挥抗真菌作用。GC-MS分析进一步鉴定出13种生物活性化合物，包括1-三十三烷醇乙酸酯、1-二十二烷醇乙酸酯和γ-谷甾醇等，这些化合物不仅有助于植物生长，还可能增强植物的抗病能力。

#### 3.4 生物活性评估

在体外实验中，AKH-5表现出多种促进植物生长的特性。其产生的IAA、铁载体、氰化氢、氨和ACC脱氨酶均对植物生长有积极影响。此外，该菌株的细胞外酶活性（如淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶等）被证实能够降解病原菌的细胞壁，促进土壤养分循环，从而增强植物的抗病能力。

#### 3.5 生物制剂的温室试验

在温室条件下，AKH-5生物制剂显著提高了pigeon pea的生长参数，包括根长、茎长、根鲜重和茎鲜重。病害严重度在AKH-5生物制剂与病原菌共处理的组别中最低，仅为31.24±1.52%。这表明AKH-5不仅能够抑制病原菌的生长，还能促进植物的健康生长。

#### 3.6 植物体内菌丝定殖实验

通过植物体内菌丝定殖实验，AKH-5被证实能够在pigeon pea的根部进行有效的定殖。处理后的根部样本在4-8天内显示出显著的菌丝生长，而对照组（仅用无菌水处理）则未观察到菌丝生长。这表明AKH-5能够通过根部定殖，增强植物的系统抗性，从而有效抑制病原菌的侵染。

#### 3.7 真菌提取物的植物生长促进作用

在体外条件下，AKH-5的真菌提取物显著促进了pigeon pea种子的萌发和生长。与对照组相比，处理组的种子萌发率和活力指数均有所提高，其中AKH-5与病原菌共处理的组别表现出最高的萌发率（93.21±0.33%）和活力指数（1202）。这表明AKH-5的真菌提取物不仅具有抗真菌活性，还能有效促进植物的生长和发育。

### 4. 讨论与意义

*Fusarium* wilt在pigeon pea中的发生率较高，尤其是在开花和结荚阶段，病害严重程度可达95%。这种病原菌的土壤传播特性使得其防控难度较大。当前的防控措施如抗病品种、种子处理和综合管理策略虽然在一定程度上有效，但效果有限。因此，探索一种生态友好的生物防治方法具有重要意义。

AKH-5菌株在体外实验中表现出显著的抗真菌活性，其VOCs和次生代谢产物能够有效抑制*F. oxysporum*的生长。此外，该菌株还具有多种促进植物生长的特性，如IAA的产生、铁载体的合成、磷溶解、氰化氢和氨的生成，以及ACC脱氨酶的活性。这些特性表明AKH-5不仅能够直接抑制病原菌，还能通过激活植物的防御反应，增强其对病害的抵抗力。

AKH-5的细胞外酶活性进一步支持其在生物防治中的应用。这些酶能够降解病原菌的细胞壁，促进土壤有机质的分解，从而改善土壤健康。同时，其通过多种机制（如竞争营养、分泌抗菌物质、激活系统抗性）实现对病原菌的控制。

在温室试验中，AKH-5生物制剂表现出良好的应用效果，显著提高种子发芽率和活力指数，并有效降低病害严重度。这表明AKH-5具有良好的生物制剂潜力，能够作为可持续农业的新型生物防治工具。

### 5. 结论

综上所述，AKH-5菌株在控制*pigeon pea*萎蔫病方面表现出显著的生物防治潜力。其通过多种机制（如VOCs分泌、次生代谢产物的产生、酶活性和植物激素的合成）抑制病原菌的生长，并促进植物的健康生长。温室试验进一步验证了其在实际应用中的有效性，表明其生物制剂能够显著提高种子发芽率和植物生长参数，同时降低病害发生率。此外，其在植物根部的定殖能力增强了系统的抗病性，为可持续农业提供了新的思路。

本研究不仅揭示了AKH-5的多重功能，还为未来开发基于*Trichoderma*属的生物防治剂提供了理论依据和实验支持。通过优化其生物制剂的制备方法，如采用滑石粉作为载体和冷冻干燥技术，可以有效提高其稳定性，延长保存期限，从而增强其在农业中的应用价值。未来的研究可以进一步探索AKH-5在不同作物中的应用效果，并结合纳米技术等先进手段，开发更加高效的生物防治策略。