利用SPR成像技术实现对癌症生物标志蛋白的超灵敏多重检测

《Microchemical Journal》：Ultrasensitive multiplexed detection of cancer biomarker proteins using SPR imaging

表面等离子体共振成像（SPRi）结合微流控芯片和磁珠分离技术，实现了对PSA、IGF-I、VEGF-D、CD14四种前列腺癌生物标志物的多plex检测，检测限低至pg/mL级，动态范围达四数量级。

　　癌症是全球范围内的主要致死原因之一，其诊断过程仍面临耗时、昂贵且缺乏特异性的问题。为了解决这一难题，我们探索了使用表面等离子共振成像（SPRi）技术对四种与侵袭性前列腺癌相关的癌症生物标志物进行多靶点检测的方法。该生物标志物组包括前列腺特异性抗原（PSA）、胰岛素样生长因子I（IGF-I）、血管内皮生长因子D（VEGF-D）以及单核细胞表面抗原（CD14）。我们采用了一种16个检测点的SPR芯片阵列，该芯片表面被功能性抗体（Ab?）修饰，用于捕捉目标生物标志物。为了确保检测的准确性，我们还使用了牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照。整个系统被封装在一个3D打印的微流控通道中，以实现样本和试剂的精确输送。通过将抗原预先捕获在磁珠（MBs）上，这些磁珠表面被二次抗体（Ab?）标记，随后将磁珠流过SPR芯片，以收集和分析表面等离子共振信号。这种方法使我们能够实时监测抗原与芯片上固定抗体之间的结合过程，并在达到平衡后对目标抗原进行定量分析。该检测方法能够实现PSA的动态范围为10 fg/mL至100 pg/mL，CD14的动态范围为1 pg/mL至100 pg/mL，IGF-I的动态范围为1.1 pg/mL至110 pg/mL，VEGF-D的动态范围为0.5 pg/mL至100 pg/mL。同时，该多靶点检测方法的检测限（LOD）分别为CD14为7.6 pg/mL，IGF-I为5.8 pg/mL，VEGF-D为5.3 pg/mL，动态范围可覆盖四个数量级，达到125 pg/mL。尽管目前尚未将该系统应用于真实样本的分析，但其展示了高通量分析的潜力，尤其在早期识别前列腺癌方面具有重要意义。该系统能够以极高的灵敏度（低至几pg/mL）检测选定的前列腺癌生物标志物，为疾病的诊断、预后和治疗评估提供了更精确的工具。

当前癌症诊断主要依赖于临床症状的显现，随后进行一系列影像学检查，最终可能需要组织活检和组织病理学分析。前列腺癌作为男性中最常见的癌症类型，传统上通过直肠指检（DRE）和经直肠超声引导下的活检（TRUS）进行检测。然而，这些方法都较为非特异，并且涉及侵入性操作。为了提供一种更非侵入性的替代方案，血清前列腺特异性抗原（PSA）检测被引入作为筛查工具。尽管PSA检测被广泛应用，但由于非癌症状态下PSA水平也可能升高，如良性前列腺增生和前列腺炎，因此该检测方法容易产生高比例的假阳性结果。为了解决这一问题，我们识别了一组生物标志物，这些标志物显著提高了基于生物标志物的检测方法的特异性，优于单独的PSA检测。特别是将PSA与IGF-I、VEGF-D和CD14进行多靶点检测，可以实现对中度与侵袭性前列腺癌的诊断特异性与灵敏度达到84%。生物标志物在癌症发展过程中会发生显著变化，这使得它们在临床诊断中具有重要价值，为疾病预后、诊断和治疗方案评估提供了更快速、更敏感的工具。

胰岛素样生长因子（IGFs）对正常细胞和异常细胞具有促增殖和抗凋亡作用，并且在癌症的发展过程中发挥重要作用。IGFs分为两种类型：IGF-I和IGF-II。IGF-I已被证明可以促进多种间皮细胞的发育，包括心肌细胞、成骨细胞和软骨细胞。特别是，IGF-I被认为是前列腺癌发生的一个风险因素。根据Roddam和Allen的研究，IGF-I水平的升高与前列腺癌发生的风险增加密切相关。

血管内皮生长因子（VEGF）也被称为血管通透性因子（VPF），是一种由细胞产生的信号蛋白，能够刺激血管的形成。VEGF-D是VEGF家族的一员，它能够激活VEGFR-2，该受体位于内皮细胞上，同时VEGFR-3则是在成体组织的淋巴内皮中表达的受体。这意味着VEGF-D可以促进肿瘤的血管生成和淋巴管生成，为癌症的发展提供了支持。

CD14是一种53kD的糖蛋白，它作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的受体。CD14的膜结合型（mCD14）或可溶型（sCD14）形式是人类先天免疫系统的重要组成部分，能够产生促炎性细胞因子。血清中sCD14浓度的增加与感染、脓毒症或死亡率的增加有关。癌症与炎症之间存在联系，炎症性疾病会增加多种癌症类型（包括膀胱、宫颈、胃、肠道、前列腺和甲状腺癌）的发生风险，这意味着CD14可以在患者血液中被检测到，特别是在这些癌症类型发展的过程中。

前列腺特异性抗原（PSA）是一种由前列腺产生的糖蛋白。PSA检测于1994年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于癌症检测。其功能是使精液液化，并且在血清中表达水平在1至3 ng/mL之间。然而，由于PSA检测的准确性和灵敏度存在不足，因此需要开发新的方法来提高PSA检测的效能，例如使用PSA衍生物和其他生物标志物进行联合检测。

多靶点生物标志物的检测试验已经通过多种技术实现，包括电化学方法、化学发光方法、电化学发光方法和荧光方法。这些方法虽然能够提供便捷、快速和敏感的诊断试验，但通常需要大量的洗涤和标记步骤才能生成最终信号。这往往涉及使用专门的试剂以及精确的试剂和洗涤缓冲液的输送，以减少非特异性相互作用和背景噪声。此外，大多数检测方法仅能提供终点测量，无法提供实时相互作用动力学的信息。监测结合动力学的能力可以为试验优化、性能评估和验证提供有价值的信息。基于生物标志物与表面固定受体之间的结合的表面等离子共振（SPR）生物传感被认为是早期诊断的有希望工具。SPR传感技术已被应用于多个领域，如药物开发、食品质量控制、环境监测和临床分析。随着技术的发展，SPR传感领域也取得了一些重要的进展。例如，表面等离子共振成像（SPRi）技术，也被称为“SPR显微镜”，是一种进步，它结合了扫描角度SPR测量的灵敏度和成像的空间能力。一些亲和系统，如DNA/DNA、RNA/DNA、DNA结合蛋白、RNA适配体/蛋白、抗体-抗原和碳水化合物/蛋白，已被应用于SPRi中。亲和相互作用可以在没有标签的情况下实时监测，如同经典的SPR传感。然而，不仅能够同时监测传感器图（即共振信号与时间的关系），还能够通过使用CDD（CCD相机）来可视化整个生物芯片表面。

一些研究已经使用SPR系统对特定的癌症生物标志物进行了分析。通过将适配体和抗体受体固定在SPR芯片上，可以实现对不同蛋白生物标志物的特异性检测。此外，将抗IgE修饰的金纳米棒用于适配体功能化的SPR界面，可以实现免疫球蛋白E（IgE）的亚摩尔级检测。在另一项研究中，使用适配体修饰的量子点作为SPR信号增强剂，可以实现血清中C反应蛋白的zeptomolar级检测。Uludag和Tothill的研究表明，通过进行夹心试验，使用抗体修饰的金纳米颗粒，可以实现前列腺特异性抗原（PSA）生物标志物的8.5 pM检测限。

在本研究中，我们旨在探索表面等离子共振成像（SPRi）技术在分析四种与侵袭性前列腺癌相关的生物标志物中的应用。这些生物标志物被认为在识别和分层前列腺癌患者方面具有潜力，包括PSA、VEGF-D、IGF-I和CD14。该系统集成了一个16个检测点的SPR芯片，该芯片被封装在一个3D打印的微流控通道中，允许将磁珠上捕获的抗原精确输送至功能化检测点，从而实现四种生物标志物的同时检测。该检测方法能够在微流控通道中同时进行，以识别特定蛋白质并确定癌症类型。

在本工作中，我们展示了基于微流控通道的SPRi系统在多靶点检测中的应用，这为前列腺癌的识别和分层提供了新的思路。该系统首先针对PSA进行了优化，随后用于同时检测CD14、IGF-I和VEGF-D，其检测限与已报道的电化学方法相当，并且至少比传统ELISA方法敏感100倍。该检测方法的实现依赖于简单且高效的步骤，能够在保持高灵敏度的同时，实现多靶点检测的可行性。

该SPRi免疫阵列利用多个捕获抗体，这些抗体能够与金表面结合，用于癌症生物标志物的检测。磁珠表面被二次抗体修饰，用于捕获CD14、IGF-I和VEGF-D生物标志物。这些磁珠随后与SPRi芯片上的特定捕获抗体结合，从而实现了在PBS中检测皮克克级抗原的能力，达到了极低的检测限，并且动态范围覆盖了3至4个数量级。该系统展示了高灵敏度和高通量检测的潜力，为癌症的早期诊断和精准医疗提供了新的方向。

此外，本研究还强调了该系统的实际应用价值。虽然目前尚未将该系统应用于真实样本的检测，但其在实验室环境中的表现已经显示出显著的优势。通过将检测过程与微流控技术相结合，该系统能够实现高通量、高灵敏度的多靶点检测，这在临床诊断中具有重要的意义。特别是在前列腺癌的早期识别方面，该系统能够提供更精确的诊断结果，从而帮助医生制定更有效的治疗方案。

该系统的设计和优化体现了跨学科合作的重要性。从生物化学到材料科学，再到微流控技术和生物传感技术，多个领域的知识和技术被整合，以实现一个高效的检测平台。同时，该研究也展示了在实际应用中面临的挑战，例如如何确保检测的准确性，如何减少非特异性相互作用，以及如何实现高通量检测的同时保持高灵敏度。通过不断优化和改进，这些挑战可以被逐步克服，从而推动该技术在临床诊断中的应用。

该研究还突出了多靶点检测在癌症诊断中的重要性。通过同时检测多个生物标志物，可以提高诊断的准确性和特异性，从而减少误诊和漏诊的风险。此外，多靶点检测还可以提供更全面的疾病信息，帮助医生更好地评估患者的病情，并制定个性化的治疗方案。例如，通过检测PSA、IGF-I、VEGF-D和CD14，可以更准确地判断前列腺癌的侵袭性，从而为患者提供更精准的治疗建议。

该研究的成果为未来癌症诊断技术的发展提供了新的思路。通过将SPRi技术与微流控技术相结合，可以实现更快速、更敏感的检测，同时减少检测过程中的复杂步骤。此外，该系统还可以被应用于其他类型的癌症检测，为多种癌症的早期识别和精准医疗提供支持。因此，该研究不仅在前列腺癌诊断方面具有重要意义，也为其他癌症的诊断提供了借鉴。

总之，本研究通过创新性的设计和优化，展示了基于SPRi技术的高通量、高灵敏度多靶点检测方法在癌症诊断中的应用价值。该系统能够实现对多种生物标志物的同时检测，为疾病的早期识别和精准医疗提供了新的工具。随着技术的不断进步，该系统有望在未来的临床诊断中发挥更大的作用，为患者提供更准确、更快速的检测结果。