基于LSU基因的巢式PCR与实时荧光定量PCR技术检测花椒锈病菌（Coleosporium zanthoxyli）的开发与应用

针对花椒锈病早期检测难题，四川农业大学团队开发了靶向Coleosporium zanthoxyli保守LSU基因的巢式PCR（灵敏度2.5 pg/μL）和qPCR（灵敏度250 fg/μL）检测体系。该研究首次实现无症状期病原检测，为农业早期预警提供分子工具，相关成果发表于《Physiological and Molecular Plant Pathology》。

　　

花椒作为我国重要的经济林木，其叶片常遭受锈病菌（Coleosporium zanthoxyli）的侵袭。这种病原真菌在潜伏期难以察觉，一旦出现典型病斑便迅速通过气流传播，传统化学防治往往为时已晚。更棘手的是，花椒锈病会导致叶片早落、果实减产，严重影响"川椒""秦椒"等特色品种的经济价值。面对这一困境，四川农业大学的科研团队决定从分子诊断技术突破，开发能"未病先知"的检测手段。

研究人员选择靶向病原菌核糖体大亚基（LSU）基因的保守序列，创新性地构建了巢式PCR（Nested PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）两套检测系统。其中巢式PCR通过内外引物二次扩增，将检测灵敏度提升至2.5 pg/μL；而采用TaqMan探针的qPCR更是达到250 fg/μL的超高灵敏度，相当于能从1微升溶液中检测出约50个病原菌基因组拷贝。在四川地区人工接种和自然感染样本的验证中，这些方法甚至在叶片尚未出现黄斑前7天就能捕获病原信号。

关键技术包括：1）从20株菌株（含15株对照菌）中提取DNA；2）梯度退火温度优化巢式PCR体系；3）建立基于LSU4-F/R引物的qPCR标准曲线；4）田间样本无症状期检测验证。

【研究结果】

• 菌株特性：从四川花椒叶片分离的5株C. zanthoxyli（保存号SICAUCC HJ23-0016至0020）显示典型锈孢形态。

• 条件优化：巢式PCR在53°C退火时获得单一451bp条带，qPCR扩增效率达98.7%。

• 特异性验证：对柱锈菌、鞘锈菌等近缘种无交叉反应。

• 灵敏度比较：qPCR比常规PCR灵敏度高1000倍。

【结论与意义】

该研究突破传统病理学诊断的时空局限，首次建立针对花椒锈病的分子预警体系。特别值得注意的是，团队发现核糖体ITS序列在锈菌中易发生变异，而LSU基因则保持高度保守性——这一发现为其他植物锈病检测提供了靶点选择新思路。正如通讯作者Shan Han强调的，该方法可整合到"智慧农业"监测网络，实现从被动治疗到主动防控的范式转变。未来通过优化引物设计（如增加β-tubulin基因靶点）和开发便携式检测设备，这项技术有望成为保障我国花椒产业健康发展的"分子卫士"。