花椒锈病早期分子检测技术：基于LSU基因的巢式PCR与实时荧光定量PCR方法开发及应用

花椒锈病(Coleosporium zanthoxyli)严重危害花椒属植物健康，传统防治手段难以应对其潜伏期传播。四川农业大学团队创新性开发了基于LSU基因的巢式PCR(检测限2.5 pg/μL)和qPCR(灵敏度250 fg/μL)检测体系，首次实现无症状期病原检测，为农业早期预警提供关键技术支撑。

　　

花椒作为我国特色经济树种，其栽培过程中面临的最大威胁之一便是由Coleosporium zanthoxyli引起的锈病。这种病原菌狡猾异常，能在叶片中潜伏长达数月而不显症状，一旦出现典型病斑，随风传播的孢子便会在田间形成爆发态势。更棘手的是，传统化学防治对已发病植株效果有限，且无法阻断潜伏期传播链。面对这一产业痛点，四川农业大学森林病理实验室的研究团队另辟蹊径，将突破口锁定在分子诊断领域——能否像核酸检测新冠病毒那样，在花椒叶片尚未出现症状时就捕捉到病原菌的蛛丝马迹？

这项发表在《Phytomedicine》的研究创新性地选取核糖体大亚基(LSU)基因作为靶标，相比常规使用的ITS序列，LSU在锈菌中具有更高的保守性和稳定性。研究人员首先从四川本地染病花椒叶片中分离获得20株菌株（编号SICAUCC HJ23-0001至0020），通过梯度温度测试优化出巢式PCR最佳退火温度53°C，并建立双重保障的检测体系：外层引物LSU4-F/R扩增451bp片段，内层引物CZ-F/R进一步放大特异性。

关键技术路线包含三大创新点：一是采用巢式PCR与qPCR双轨验证，其中巢式PCR检测限达2.5 pg/μL DNA，相当于单个孢子基因组含量的千分之一；二是qPCR体系引入TaqMan探针，将灵敏度提升至250 fg/μL，比常规PCR高三个数量级；三是通过20株不同来源菌株验证，证明该方法可区分C. zanthoxyli与其他锈菌（如Puccinia spp.）。

【Optimization of the Reaction Conditions of Nested PCR】

温度梯度实验显示，53°C退火时扩增条带单一明亮，而48-52°C和54-57°C均出现杂带。对人工接种7天后的无症状叶片检测发现，巢式PCR比常规PCR早5天检出病原。

【DISCUSSION】

研究揭示了现有防控体系的局限性：化学药剂对气传孢子效果有限，且无法清除潜伏侵染。新建立的分子检测窗口期比症状出现提前10-14天，为精准施药提供决策依据。值得注意的是，团队发现ITS序列在锈菌中易发生种内变异，而LSU基因的保守特性使其成为更可靠的分子标记。

【CONCLUSION】

该研究首次实现花椒锈病潜伏期分子诊断，建立的双标准检测体系兼具巢式PCR的高特异性和qPCR的定量优势。作者建议未来可开发便携式检测试剂盒，并与遥感技术结合构建病害预测系统。正如通讯作者Shan Han在讨论部分强调的，这项技术不仅适用于花椒锈病，其设计思路还可拓展至其他林木锈病的早期监测领域。

这项来自中国西南地区的研究，为全球植物病害分子监测提供了创新范式——当传统方法遭遇瓶颈时，从基因层面突破或许正是打开困局的金钥匙。正如研究者所言，早期诊断的价值不仅在于挽回经济损失，更在于改变"见病才治"的被动局面，让植物保护真正步入精准化时代。