对Heterosentis holospinus Amin（Heckman & Ha, 2011，属于Palaeacanthocephala: Echinorhynchida: Arhythmacanthidae）的完整线粒体基因组进行特征分析，并探讨其线粒体系统发育关系

《Mitochondrial DNA Part B》：Characterizing the complete mitogenome of Heterosentis holospinus Amin, Heckman & Ha, 2011 (Palaeacanthocephala: Echinorhynchida: Arhythmacanthidae) and its mitochondrial phylogeny

寄生吸虫异拟蜱虫属H. holospinus的系统发育与线粒体基因组研究揭示其新宿主Cynoglossus bilineatus，完整线粒体基因组长度16560bp，包含36个基因，支持属内单系群，为扁形动物门分类提供分子证据。

　　本次研究主要聚焦于一种寄生性棘头虫——*Heterosentis holospinus* Amin, Heckman & Ha, 2011的完整线粒体基因组的测序与注释工作。该物种最初被描述为寄生于*Plotosus lineatus* Thunberg, 1787和*Equulites equulus* Forssk?l, 1775，但本研究发现其也可感染*Cyngoglossus bilineatus* Lacepède, 1802，这一新宿主的发现扩展了其已知的宿主范围。在本次研究中，我们对*H. holospinus*的线粒体基因组进行了完整测序，长度为16,560个碱基对，包含36个基因，其中包括22个tRNA基因、12个蛋白质编码基因（PCGs）和2个rRNA基因（*rrnS*和*rrnL*）。值得注意的是，该线粒体基因组中存在两个非编码区域（NCRs），并且缺少*atp8*基因。所有基因均位于重链上，基因数量和排列方式与同属的*H. pseudobagri*一致。

通过对这些基因组数据的分析，我们构建了一个包含35个其他棘头虫线粒体基因组的系统发育树，进一步澄清了棘头虫纲（Acanthocephala）的分类地位及其进化关系。系统发育分析的结果表明，*H. holospinus*与*H. pseudobagri*形成了一个被良好支持的姐妹群，代表了*Heterosentis*这一属。该姐妹群进一步与*Pseudoacanthocephalus*属的成员聚类，并与*Echinorhynchida*目中的其他属或科的谱系进行层级分析。这一发现不仅支持了该属的单系性，也验证了之前基于形态学和分子数据的分类结论。

此外，本研究还揭示了*H. holospinus*的线粒体基因组中存在一个较长的串联重复区域，这可能是其线粒体基因组长度达到16,560个碱基对的主要原因。类似的串联重复区域也曾在*Micracanthorhynchina dakusuiensis* Harada, 1938和*Pallisentis celatus* Van Cleave, 1928中被发现，但未在与之亲缘关系较近的*H. pseudobagri*中观察到。这种串联重复的进化意义尚不明确，需要在更多棘头虫谱系中进行比较研究，以进一步揭示其在分类学和系统进化中的作用。

在基因组的结构和组成方面，*H. holospinus*的线粒体基因组显示出显著的A+T含量，达到61.5%，其中T碱基占比最高（37.5%），其次是A（24.0%）、G（29.3%）和C（9.2%）。AT偏斜值为-0.22，GC偏斜值为0.521，表明其基因组在碱基组成上具有一定的偏斜特征。对于12个PCGs，有8个起始密码子为GTG，3个为ATG，1个为ATT。在终止密码子方面，有4个以TAG结束，2个以TAA结束，而其余6个则为截断形式。这些密码子的使用频率反映了该物种在蛋白质合成过程中的遗传特性，其中缬氨酸（Val）是最丰富的氨基酸，而亮氨酸（Leu）的编码方式UUA是最常见的。相比之下，谷氨酰胺（Gln）是该线粒体基因组中含量最少的氨基酸，而CGC是使用频率最低的密码子，仅出现一次。

本研究的发现具有重要的分类学和生态学意义。首先，*Cynoglossus bilineatus*被确认为*H. holospinus*的新终宿主，这表明该寄生虫具有较强的生态适应能力，能够寄生于不同的鱼类宿主。其次，通过线粒体基因组的系统发育分析，我们进一步验证了*Heterosentis*这一属的单系性，这与之前基于形态学和分子数据的研究结果相一致。线粒体基因组在分类学研究中的重要性日益凸显，特别是在解决属和科级别的分类关系方面，它为理解棘头虫纲的系统进化提供了关键的分子数据支持。

从方法学角度来看，本次研究采用了多种先进的技术和手段。首先，在样本采集和DNA提取阶段，我们使用了TIANamp Micro DNA Kit提取总基因组DNA，并结合形态学鉴定确认了*H. holospinus*的特征。随后，我们通过长距离PCR技术扩增了完整的线粒体基因组，并利用重叠片段进行拼接。为了确保基因组的完整性，我们设计了特异性引物，并通过BLASTn技术验证了这些引物的特异性，以避免非特异性结合。此外，我们还采用了纳米孔测序技术对重复区域进行验证，进一步提高了基因组组装的准确性。

在基因组的注释和分析过程中，我们使用了DNASTAR v7.1进行基因组的拼接，利用ARWEN v1.2和MITOZ v3.4.2对tRNA基因进行注释，并通过比较已发表的棘头虫线粒体基因组对结果进行验证。为了更好地展示线粒体基因组的结构，我们使用了Proksee生成了线粒体基因组的环形图，并利用PhyloSuite v1.2.3对密码子使用频率和相对同义密码子使用（RSCU）进行了分析。这些分析结果不仅提供了该物种基因组的结构信息，也为进一步的系统发育研究奠定了基础。

本研究的系统发育分析采用了最大似然法（Maximum Likelihood），利用12个PCGs构建了系统发育树，并结合1000次超快速自举分析（ultrafast bootstraps）确保了结果的可靠性。分析结果表明，*H. holospinus*与*H. pseudobagri*形成了一个被良好支持的姐妹群，代表了*Heterosentis*这一属。这一姐妹群进一步与*Pseudoacanthocephalus*属的成员聚类，并与*Echinorhynchida*目中的其他属或科的谱系进行层级分析。这一结果不仅支持了该属的单系性，也表明线粒体基因组在解决棘头虫纲的分类关系方面具有重要作用。

此外，本研究还强调了线粒体基因组在分类学研究中的潜力。通过比较不同物种的线粒体基因组，我们可以更准确地确定它们之间的进化关系和分类地位。在棘头虫纲中，线粒体基因组的分类学研究仍处于初步阶段，因此，本研究的成果将有助于填补这一领域的知识空白，并为未来的分类学研究提供更全面的数据支持。同时，*C. bilineatus*作为新终宿主的发现，也揭示了*H. holospinus*在不同生态环境中的适应性，为理解宿主-寄生虫相互作用提供了新的视角。

在生态学意义方面，*H. holospinus*的宿主范围扩展表明其具有较强的适应能力，能够在不同的鱼类宿主中生存和繁殖。这一发现不仅对理解该寄生虫的生态行为具有重要意义，也可能对相关鱼类生态系统的健康状况产生影响。同时，该寄生虫在淡水和海水鱼类中的分布，也表明其具有一定的地理分布特征，这可能与其适应不同环境的能力有关。

在研究的伦理方面，本研究使用的鱼类均为未受保护的物种，且研究过程符合中国关于实验动物管理和实验室动物福利伦理审查的相关规定。所有实验均在2019年获得广东省科技厅的批准，确保了研究的合规性和科学性。

综上所述，本次研究通过测序和注释*H. holospinus*的完整线粒体基因组，不仅扩展了该属的分子数据，还揭示了其在系统发育分析中的重要性。同时，新终宿主的发现进一步支持了该寄生虫的生态适应能力，并为理解宿主-寄生虫关系提供了新的数据支持。此外，研究中采用的多种技术和方法也为未来的分类学和系统发育研究提供了参考和借鉴。通过这一研究，我们不仅深化了对棘头虫纲的理解，也为相关领域的进一步发展奠定了基础。