磷酸化Y14相分离凝聚体作为DNA双链断裂修复支架的创新机制及其抗癌治疗潜力

本研究揭示了RNA结合蛋白Y14/RBM8A通过磷酸化依赖的相分离机制在DNA双链断裂(DSB)修复中的关键作用。研究人员发现SRPK1介导的Y14磷酸化促进其与Mg2+依赖的液-液相分离(LLPS)，形成修复支架并招募非同源末端连接(NHEJ)核心因子Ku70/80，而破坏该过程可增强抗癌药物敏感性。该成果为靶向DNA修复相分离的抗癌策略提供了新思路。

　　

基因组稳定性维持是细胞生存的核心课题，而DNA双链断裂(DSB)作为最致命的DNA损伤类型，其修复机制缺陷与癌症发生密切相关。目前，虽然已知非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)是主要修复途径，但修复因子如何快速精准定位损伤位点的动态调控机制仍不明确。近年来，液-液相分离(LLPS)现象在DNA损伤应答(DDR)中的作用备受关注，但具体分子机制及其治疗潜力亟待探索。

中国科学院生物医学科学研究所的研究团队在《iScience》发表重要成果，通过多学科技术手段揭示了RNA结合蛋白Y14/RBM8A通过磷酸化依赖的相分离机制调控DSB修复的全新机制。研究采用HaloTag活细胞成像技术追踪Y14在激光诱导DNA损伤位点的动态分布，结合体外LLPS实验证实Mg²⁺对磷酸化Y14相分离的关键作用，并通过NHEJ修复实验和抗癌药物敏感性分析验证其功能意义。

关键技术方法包括：1）HaloTag活细胞成像系统实时监测Y14在DNA损伤位点的招募动力学；2）Phos-tag凝胶电泳分析SRPK1介导的Y14磷酸化状态；3）体外重建实验解析Mg²⁺/PEG诱导的磷酸化Y14相分离特性；4）荧光漂白恢复(FRAP)技术测定凝聚体流动性；5）Cas9/sgRNA系统评估NHEJ修复效率。

主要研究结果

Y14在DNA损伤位点的RNA依赖性定位
通过HaloTag标记技术首次观测到Y14在激光微辐照诱导的DNA损伤位点快速聚集，这种定位依赖于IncRNA HOTAIRM1和RNA聚合酶II活性。RNA结合缺陷突变体W73V完全丧失损伤位点募集能力，证实其RNA依赖性特征。

磷酸化依赖的Y14定位与修复功能
SRPK1抑制剂处理或磷酸化位点突变(SA)均显著抑制Y14向损伤位点的募集。Phos-tag电泳证实SRPK1介导Y14 C端RS结构域的磷酸化修饰，这种修饰对恢复Y14缺失细胞的NHEJ修复活性至关重要。

Mg²⁺促进磷酸化Y14的相分离
体外实验发现生理浓度Mg²⁺（2.5-5 mM）可特异性诱导磷酸化Y14形成液滴状凝聚体，而EDTA处理可逆性解聚。FRAP分析显示凝聚体保持液体特性，3% PEG可增强相分离效率。

Y14凝聚体招募Ku70/80的分子机制
电荷分布分析显示Ku70-2内在无序区(IDR)与Y14存在静电互补。荧光标记实验证实Ku70/80异源二聚体优先分区进入磷酸化Y14凝聚体，而HOTAIRM1 RNA可协同增强该过程。

EDTA敏感性的修复因子招募模式
细胞穿透性EDTA-AM处理选择性破坏Y14及NHEJ核心因子(Ku70、DNA-PKcs、LIG4、XLF)在损伤位点的定位，但不影响PAR聚合物和FUS的早期响应，揭示Mg²⁺依赖的Y14相分离在修复支架组装中的特异性作用。

SRPK1抑制增强抗癌疗效
SRPK1抑制剂SRPIN340通过干扰Y14磷酸化，使癌细胞对电离辐射(IR)和喜树碱(CPT)的敏感性显著提升，联合处理可协同抑制细胞增殖和集落形成能力。

该研究创新性地阐明了磷酸化Y14通过Mg²⁺依赖的相分离形成动态修复支架的分子机制，突破性地将RNA代谢、蛋白质翻译后修饰与相分离调控网络整合到DSB修复理论框架中。特别重要的是，研究证实靶向Y14相分离可选择性增强癌细胞对DNA损伤因子的敏感性，为开发基于"合成致死"策略的新型抗癌疗法提供了理论依据和潜在靶点。这一发现不仅深化了对DNA修复区室化调控的认识，也为相分离研究在精准医学中的应用开辟了新途径。