酵母CST复合物介导切除后非同源末端连接修复途径并促进局部缺失的机制研究

本研究揭示了酿酒酵母中CST复合物(Cdc13/Stn1/Ten1)通过招募Polα-primase进行填补合成，在DNA双链断裂(DSB)切除后介导备份性非同源末端连接(NHEJ)修复的新机制，该途径促进5-85 bp局部缺失形成，同时防止更大规模缺失，为理解基因组稳定性调控提供了新视角。

　　

在生命活动中，DNA双链断裂(DSB)是最致命的基因组损伤类型之一。细胞演化出两种主要修复机制：需要同源模板的高保真同源重组(HR)，以及直接连接断裂末端的快速但易出错的非同源末端连接(NHEJ)。传统观点认为，DNA末端的5'切除会不可逆地导向HR途径，而NHEJ仅作用于未切除的末端。然而，这种二元对立模型无法解释某些修复过程中出现的中间尺度缺失现象，暗示存在未被发现的修复调控机制。

法国索邦大学(Université Paris Cité)的研究团队通过构建无端粒的环形染色体酵母模型，首次揭示端粒保护复合物CST(Cdc13/Stn1/Ten1)在DSB切除后阶段的关键作用。这项发表于《Cell Genomics》的研究发现，CST通过与DNA聚合酶α-引物酶(Polα-primase)相互作用，在切除起始后形成"备份性NHEJ"修复途径，产生5-85 bp的特征性局部缺失，同时有效阻止更大规模的基因组缺失。

研究主要采用四种关键技术：1) 通过Cas9诱导和Hi-C验证构建单环形染色体酵母模型；2) 高通量测序分析DSB修复突变特征；3) 定量PCR检测ssDNA积累评估切除程度；4) 质粒再连接实验区分精确与不精确NHEJ效率。

主要研究结果

CST复合物促进不精确NHEJ修复
在环形染色体酵母中诱导Cas9介导的DSB后，野生型菌株主要通过NHEJ产生三类突变：单碱基插入、1-4 bp小缺失(SDs)和5-85 bp中等缺失(IDs)。STN1缺失使IDs频率降低5-10倍，证实CST特异性促进中等尺度缺失形成。

CST-Polα-primase互作限制切除扩展
ssDNA定量和单链退火(SSA)实验显示，stn1△和pol1-236 pol12-216(Polα互作缺陷突变体)中ssDNA积累增加2-5倍。这表明CST通过招募Polα-primase进行填补合成，将切除限制在局部范围，防止形成更长的ssDNA。

修复途径选择的动态调控
当CST功能缺失时，未被遏制的长程切除导致微同源介导末端连接(MMEJ)依赖性的大规模缺失(LDs)增加10倍。这种"全或无"的修复模式揭示CST在修复途径选择中的枢纽作用：适度切除时促进NHEJ/MMEJ介导的IDs，过度切除时则抑制有害的LDs。

保守性机制探索
在裂殖酵母Rev7和Rif1突变体中观察到类似stn1△的IDs减少表型，暗示53BP1-RIF1-Shieldin通路的部分保守性，尽管酵母缺乏完整的Shieldin复合体。

这项研究颠覆了"切除必然排斥NHEJ"的传统认知，提出三阶段修复模型：1) 初始NHEJ产生小突变；2) 适度切除后CST-Polα介导填补合成，形成可被NHEJ利用的RNA-DNA杂交结构，产生IDs；3) 失控切除导致MMEJ依赖性LDs。该发现不仅完善了DNA修复理论框架，还为优化CRISPR基因编辑技术提供了新思路——通过调控CST活性可能减少非预期的基因组大规模缺失。

研究还留下若干待解之谜：CST在DSB位点的精确招募机制、与Rev7/Rif1的协同方式，以及该通路在高等真核生物中的保守程度。这些问题的解答将有助于开发针对基因组不稳定相关疾病的新型干预策略。