CUT&Tag与DiBioCUT&Tag技术突破疟原虫AT富集表观基因组低样本量研究瓶颈

本研究针对疟原虫AT富集基因组表观遗传分析的技术瓶颈，开发了低样本量(10,000个核)适用的CUT&Tag技术，并创新性结合邻近生物素化技术(DiBioCUT&Tag)，成功实现了恶性疟原虫(P. falciparum)异染色质(HP1/H3K9me3)的高精度全基因组分析，为稀缺临床样本和发育阶段研究提供了突破性工具。该成果发表于《Cell Reports Methods》。

　　

疟疾作为威胁人类健康的重大传染病，其病原体恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的AT富集基因组(平均82% AT含量)给表观遗传研究带来特殊挑战。传统染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)技术存在样本需求量大(数百万细胞)、GC偏好性严重等技术瓶颈，严重制约了对疟原虫发育转换和抗原变异等关键生物学过程的研究。更棘手的是，临床分离株和蚊虫/肝期等稀缺样本因材料不足长期难以进行表观基因组分析。

荷兰奈梅亨大学(Radboud University)分子生物学系Richard Bartfai团队联合德国伯恩哈德·诺赫特热带医学研究所(Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine)的研究人员，通过技术创新成功突破这一技术壁垒。他们开发出适用于疟原虫的CUT&Tag(靶向切割与标签化)技术方案，并首创二聚体诱导生物素化CUT&Tag(DiBioCUT&Tag)方法，将表观遗传分析的灵敏度提升至前所未有的水平。这项突破性成果近期发表在方法学顶刊《Cell Reports Methods》。

关键技术方法包括：(1)优化疟原虫核分离与透化处理的CUT&Tag标准流程；(2)开发仅需10,000个核/寄生虫的低输入方案；(3)建立完整寄生虫直接检测技术，支持冻存样本分析；(4)创新性设计FKBP-FRB二聚化系统，通过miniTurbo生物素连接酶实现染色质邻近标记，结合抗生物素CUT&Tag增强信号。

【CUT&Tag实现疟原虫异染色质高精度分析】

研究人员首先验证CUT&Tag在AT富集基因组的适用性。通过比较HP1和H3K9me³的CUT&Tag与ChIP-seq数据，发现两者异染色质图谱高度一致(R²=0.65)，且信噪比显著提升(6.2 vs 13.1)。非特异性IgG对照实验证实技术本身无明显GC偏好性。特别值得注意的是，该技术成功捕捉到NF54和F12疟原虫株系间已知的染色体12末端异染色质差异，证实其检测灵敏度。

【低样本量技术突破】

研究团队将样本量逐步降低至10,000个核(相当于约0.1μL压积寄生虫)，通过建立背景信号正态分布模型(FDR 0.5%-1%)，仍能准确识别异染色质区域。基因组窗口分析显示低输入与常规样本相关性高达R²=0.92，为临床稀缺样本分析奠定基础。

【简化样本处理流程】

创新性地跳过核分离步骤，直接使用皂素提取的完整寄生虫(含冻存样本)进行CUT&Tag，获得与标准方法一致的异染色质图谱。这一改进大幅简化操作流程，使现场样本快速处理成为可能。

【DiBioCUT&Tag技术创新】

针对瞬时染色质互作蛋白检测难题，研究团队设计基因工程寄生虫系(HP1-2xFKBP-GFP/mCherry-FRB-miniTurbo)，通过雷帕霉素诱导二聚化使生物素连接酶靶向异染色质，实现局部组蛋白生物素化标记。抗生物素CUT&Tag不仅获得与传统方法相当的异染色质图谱(R²=0.97)，更成功应用于着丝粒组蛋白变体CenH3的检测。

研究讨论指出，CUT&Tag技术克服了疟原虫基因组特殊性带来的技术障碍，其低样本量特性将极大推动疟原虫发育生物学研究，特别是以往难以获取的蚊期和肝期样本分析。DiBioCUT&Tag的创新设计为染色质瞬时互作研究提供新思路，尽管需注意游离miniTurbo对开放染色质区域的背景标记效应。这些技术进展不仅对疟原虫研究具有变革意义，也为其他AT富集生物(如盘基网柄菌Dictyostelium discoideum)的表观遗传研究提供技术借鉴。

该研究通过方法学创新，成功建立了疟原虫表观遗传研究的全新技术体系，为理解抗原变异、耐药性产生等关键病理过程的表观调控机制提供了强大工具，也为抗疟药物靶点发现开辟了新途径。技术方案已通过GitHub平台共享，将推动全球疟疾研究共同体在表观遗传领域的突破性进展。