退化阶段对rd10视网膜体外非病毒组织转染效率的影响及基因治疗新策略

本研究针对遗传性视网膜疾病治疗中病毒载体存在的局限性，创新性地采用Sleeping Beauty(SB)转座子系统结合电穿孔技术，系统评估了不同退化阶段rd10视网膜的转染效率。研究人员发现退化后期(P61及以后)视网膜中转染效率显著提升，且Müller细胞是唯一被转染的细胞类型；通过优化质粒大小使转染效率提升1.5倍，同时保持视网膜结构完整性。该研究为联合视网膜假体与基因治疗提供了重要基础，发表于《Molecular Therapy: Nucleic Acids》，为遗传性视网膜营养不良的序贯治疗开辟了新途径。

　　

在眼科医学领域，遗传性视网膜疾病如视网膜色素变性(RP)影响着全球超过150万患者，其特征是进行性光感受器死亡导致的不可逆视力丧失。虽然腺相关病毒(AAV)载体已在RPE65基因治疗中取得临床突破，但病毒载体存在包装容量限制、免疫原性风险和高成本等问题。更棘手的是，RP涉及250多个基因突变，传统"一对一"基因疗法难以覆盖所有患者。面对这些挑战，德国亚琛工业大学医院眼科系(Department of Ophthalmology, Uniklinik RWTH Aachen)的Jiao Zhang等研究者将目光投向了非病毒基因递送系统。

研究团队选择rd10小鼠——携带Pde6b^rd10突变的经典RP模型，其病理特征与人类高度相似。这些小鼠在出生后18天(P18)开始出现光感受器丢失，到P60时完全退化。利用Sleeping Beauty(SB100X)转座子系统（由转座酶和包含反向末端重复序列ITRs的转座子质粒组成），研究人员开发了体外电穿孔转染技术，通过优化缓冲液、电压参数和质粒浓度，在退化不同阶段的视网膜中实现了稳定基因递送。

关键技术包括：(1)使用NEPA21 II型电穿孔仪配合铂电极，建立视网膜外植体电穿孔标准化流程；(2)采用Opti-MEM缓冲液和1:16的SB100X转座酶/pT2-CAGGS-Venus转座子质粒比例；(3)通过FITC-葡聚糖(FD4)评估膜完整性；(4)免疫荧光共定位分析转染细胞类型；(5)比较6,132bp的pT2与4,227bp的pFAR4-ITRs质粒转染效率差异。

电穿孔参数优化

研究显示10V穿孔脉冲(2次)和10V转移脉冲(5次)的组合在3月龄rd10视网膜中效果最佳。Opti-MEM缓冲液使转染效率较PBS提升91%(p=0.0352)，而质粒浓度超过0.1μg/μL未显著提高效率。

转染细胞鉴定

免疫荧光证实Venus阳性细胞与谷氨酰胺合成酶(GS)标记的Müller细胞共定位率最高(图2)，而钙视网膜蛋白(Calretinin)标记的无长突细胞和钙结合蛋白(Calbindin)标记的水平细胞均未显示转染。这种选择性可能与退化视网膜中Müller细胞的反应性胶质化有关。

退化阶段的影响

P16和P25的早期退化视网膜几乎无法转染，而P61后效率显著提升(43.15±13.13)。值得注意的是，野生型视网膜在任何阶段均未能转染，提示退化微环境（如胶质瘢痕形成）可能促进外源DNA摄取。

质粒尺寸效应

31%尺寸缩减的pFAR4-ITRs质粒使P61视网膜转染效率提升1.5倍(64.04±6.16 vs 44.35±6.89)，且在P16/P25阶段实现突破性转染。但缩小至2,984bp的ITRs-SV-Venus质粒未显示额外优势，提示CAG启动子的选择至关重要。

视网膜结构与细胞存活

H&E染色显示电穿孔后退化视网膜厚度保持稳定(100.80±0.79μm)，但野生型视网膜培养后出现层间松散。凋亡检测发现退化视网膜内核层(INL)凋亡细胞比野生型少50%，但培养仍导致INL和神经节细胞层(GCL)凋亡增加。

研究结论指出，SB转座子系统能高效转染退化视网膜，尤其靶向Müller细胞——这些细胞在晚期RP中持续存活并分泌神经营养因子。该技术为联合治疗提供新思路：通过电穿孔递送神经营养因子基因（如PEDF）的Müller细胞可延缓神经元退化，同时为视网膜假体创造更佳的电耦合环境。这种"基因-假体"联合策略有望突破当前RP治疗的局限性，为个性化医疗提供新范式。

值得注意的是，该研究首次揭示视网膜退化阶段与转染效率的关联性，为临床转化时机的选择提供依据。pFAR4质粒的应用展示抗生素抗性基因去除载体的优势，符合基因治疗安全性趋势。未来研究需解决电穿孔侵入性问题，并探索基于电极阵列的体内递送技术。