真菌剂Cyazofamid降解产物CCIM的质子载体机制及其线粒体解偶联作用研究

本研究揭示了常用杀菌剂Cyazofamid的降解产物CCIM（4-氯-5-对甲苯基咪唑-2-甲腈）通过质子载体机制诱导线粒体解偶联的作用机制。研究人员通过核磁共振（NMR）证实了Cyazofamid在DMSO/水溶液中的降解过程，并发现CCIM在亚微摩尔浓度即可显著增加大鼠肝脏线粒体呼吸速率、降低膜电位，同时在HepG2细胞中诱导线粒体膜去极化。该研究不仅阐明了CCIM的毒性作用机制，还扩展了已知影响线粒体功能的质子载体清单，为评估农药代谢产物的生物安全性提供了重要依据。

　　

在农业生产中，杀菌剂Cyazofamid因其对卵菌纲病原体的高效抑制而被广泛应用，但其环境降解产物对哺乳动物细胞的潜在毒性一直未明确。近年研究发现，该化合物在人类细胞中表现出意外的线粒体解偶联活性，这与它稳定的化学结构（pH 0-14范围内无可解离质子）形成矛盾。更引人关注的是，其降解产物CCIM作为咪唑衍生物可能具备质子载体特性，这为解释其毒性机制提供了新线索。

莫斯科国立大学的研究团队通过多维度实验证实，Cyazofamid本身并不具备解偶联活性，而其水解产物CCIM才是真正的质子载体型解偶联剂。研究采用核磁共振技术直接捕捉到DMSO溶液中Cyazofamid向CCIM的转化过程，结合荧光光谱测定发现CCIM具有pH依赖性荧光特性（pK_a=5.7）。在离体实验中，CCIM在亚微摩尔浓度即可使大鼠肝脏线粒体呼吸速率提升2.5倍，同时导致膜电位显著下降；在HepG2细胞模型中，微摩尔浓度的CCIM同样引发线粒体膜去极化。研究还通过平面双层脂膜实验首次证实CCIM能介导跨膜质子电流，其效力堪比经典解偶联剂CCCP和2,4-二硝基苯酚(DNP)。该成果发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》，为农药代谢产物的毒性评估建立了新范式。

关键技术方法包括：1）核磁共振（NMR）追踪Cyazofamid降解动态；2）荧光光谱测定CCIM的pK_a值；3）高分辨率呼吸仪检测离体线粒体氧耗；4）膜电位敏感染料JC-1评估线粒体功能；5）平面双层脂膜技术记录质子电流。

OxPhos uncoupling by CCIM in isolated rat liver mitochondria

实验显示新鲜配制的Cyazofamid对离体线粒体无显著影响，而存放5小时后的样品因产生CCIM导致呼吸控制率(RCR)从8.0降至2.5。CCIM直接处理使线粒体态4呼吸速率提升至230±15 nmol O₂/min/mg蛋白，同时膜电位下降90mV。

Protonophoric activity on bilayer lipid membranes

在DPhPC双层膜系统中，CCIM介导的质子电流密度达12±3 pA/mm²（pH梯度2.0），其效率与浓度呈正相关，证实其作为阴离子型质子载体的特性。

Fluorescence properties and pK_a determination

CCIM在pH 5.0-7.0区间呈现显著荧光变化，通过Henderson-Hasselbalch方程拟合获得pK_a=5.7±0.2，与其质子解离特性相符。

该研究不仅解析了Cyazofamid毒性作用的分子基础，更揭示了环境污染物通过"前药转化"产生生物活性的新机制。CCIM作为新型质子载体的发现，为开发线粒体靶向药物提供了先导化合物。作者特别指出，评估农药安全性时需考虑其环境转化产物，这对完善农用化学品风险评估体系具有重要指导意义。研究建立的NMR追踪降解产物方法，为类似化合物的毒性机制研究提供了技术范本。