基于病毒工程化RNA的活细胞冠状病毒传感与激活系统VERAS的构建与应用

研究人员针对活细胞中冠状病毒实时检测信号灵敏度低、依赖病毒操作和细胞固定等问题，开发了病毒工程化RNA激活系统VERAS。该系统利用病毒复制酶诱导转基因表达，实现了冠状病毒转录复制的实时监测，并能触发报告基因和治疗基因的翻译。通过整合病毒包装序列，VERAS可像"特洛伊木马"一样通过子代病毒传播至邻近细胞。该双功能系统不仅能检测多种冠状病毒感染，还可作为诱导型抗病毒系统，为病毒学基础研究和mRNA药物开发提供了新工具。

　　

冠状病毒的持续变异对全球公共卫生构成严峻挑战，但现有检测技术面临灵敏度不足、需要破坏细胞等瓶颈。传统方法如RNA toehold传感器和荧光报告系统虽能监测病毒感染，却难以实现活细胞中病毒复制的动态观测。更棘手的是，病毒逃逸突变常使靶向特定蛋白的检测方法失效。面对这些挑战，斯坦福大学（Stanford University）的研究团队另辟蹊径，从冠状病毒保守的RNA复制机制入手，开发出革命性的VERAS系统。

这项发表于《BioDesign Research》的研究，巧妙利用了冠状病毒非结构蛋白Nsp1选择性抑制宿主翻译的特性，以及病毒复制转录复合体RTC对特定RNA结构的识别机制。研究人员通过工程化改造冠状病毒5'和3'非翻译区，构建了能响应病毒感染的合成RNA元件。该系统不仅突破性地实现了活细胞中冠状病毒复制的无损监测，还能像"智能导弹"般精准递送抗病毒药物。

研究主要运用了分子克隆构建VERAS质粒库、体外转录制备RNA传感器、流式细胞术定量报告基因表达、免疫荧光共定位病毒标志物、RT-qPCR追踪VERAS复制动力学等关键技术。人类胚胎肾细胞HEK293T及其衍生细胞系（表达冠状病毒受体hAPN或hACE2）作为模型系统，使用229E、OC43和SARS-CoV-2三种冠状病毒验证系统普适性。

研究结果部分：

1. 设计合成RNA传感器检测冠状病毒转录

   通过模拟冠状病毒基因组和亚基因组RNA结构，设计6种VERAS变体。负链设计的VERAS-3和VERAS-6在229E感染后分别显示17倍和31倍的GFP表达激活，且与病毒dsRNA和 Spike蛋白共定位显著相关，证实其检测特异性。

2. VERAS转录复制特征解析

   体外转录实验证实病毒RTC能将正链VERAS转录为负链RNA，并维持其稳定性。RT-qPCR显示感染组VERAS RNA含量较mock组显著提高，证明病毒有效复制了工程化RNA。

3. VERAS双顺反子设计与病毒包装

   创新性地在VERAS中插入第二个转录调控序列TRS，实现GFP与mRuby3的共表达。将SARS-CoV-2包装信号PS整合至VERAS后，发现229E和OC43病毒能将其包装入子代病毒颗粒，使再感染细胞呈现GFP信号，证实"特洛伊木马"传播机制。

4. VERAS的广谱检测与抗病毒应用

   系统可检测低至0.0028 MOI的229E感染。当编码凋亡诱导剂Bax/Caspase 3或干扰素IFNα时，显著降低病毒滴度（IFNA8组达74%）。共培养实验显示VERAS-IFNA8可保护邻近GFP⁺细胞免受病毒破坏。

这项研究开创性地将病毒复制弱点转化为检测优势，其核心价值体现在三方面：首先，负链VERAS设计将检测灵敏度推至新高度，0.004 TCID₅₀/细胞的检测限远超传统方法；其次，双功能模块实现"检测-治疗"一体化，如基因组型VERAS-6可同时表达诊断标记和IFNα抗病毒蛋白；最后，包装信号赋予系统自我扩散能力，为开发"智能抗病毒网络"提供可能。

值得注意的是，不同冠状病毒对VERAS的激活效率存在差异，如SARS-CoV-2对VERAS的激活较弱，提示未来需针对不同病毒优化UTR设计。研究人员指出，该系统原理可拓展至其他正链RNA病毒，通过替换特定UTR序列即可实现病原体特异性检测。这种"以子之矛，攻子之盾"的策略，为应对未来新发病毒疫情提供了极具弹性的技术储备。