菠萝蛋白酶通过缓激肽/B2R-TRPV1/Ca2+/AMPK/自噬通路增强内皮细胞一氧化氮生物利用度的机制研究

为解决心血管疾病中内皮功能障碍和一氧化氮(NO)生物利用度不足的问题，研究人员开展菠萝蛋白酶(Bromelain)调控缓激肽(Bradykinin)/B2R-TRPV1-Ca2+-AMPK-自噬通路促进NO生成机制的研究。发现菠萝蛋白酶通过酶解激肽原释放缓激肽，激活B2R-TRPV1-Ca2+-AMPK-eNOS信号和自噬-尿素循环-L-精氨酸通路协同促进NO生成，为心血管保护和伤口愈合提供新靶点。

　　

心血管健康的核心在于内皮细胞功能，而内皮源性一氧化氮(NO)是维持血管稳态的关键分子。然而，在高血压、糖尿病等疾病中，NO生物利用度下降导致内皮功能障碍，成为心血管疾病的重要病理基础。目前临床使用的NO调节药物存在靶点单一、副作用明显等问题，从天然产物中寻找多靶点调控策略成为研究热点。菠萝作为传统药食两用植物，其茎提取物菠萝蛋白酶(Bromelain)已被发现具有抗炎、抗凝血等活性，但其对血管内皮保护作用的分子机制尚不明确。

为揭示这一科学问题，国立台湾大学医学院的研究团队在《Biomedicine》发表重要成果。他们通过体外内皮细胞实验和体内Matrigel血管新生模型，结合Griess法检测NO、Western blot分析蛋白表达、免疫荧光观察自噬小体等技术，系统解析了菠萝蛋白酶通过"酶-受体-通路"三级调控网络增强NO生物利用度的全新机制。

3.1 菠萝蛋白酶通过eNOS活性增加NO生成

研究发现0.125-2 μg/mL菠萝蛋白酶可时间依赖性增加NO产量，且完全依赖eNOS活性，但不改变eNOS蛋白表达水平，表明其通过激活eNOS磷酸化而非上调表达发挥作用。

3.2 酶解激肽原释放缓激肽的关键作用

菠萝蛋白酶在37℃下可时间依赖性降解重组激肽原和细胞裂解液中的激肽原，5-30分钟内使培养基缓激肽水平显著升高，而煮沸灭活的酶则丧失该活性，证实其通过蛋白水解作用参与激肽系统调控。

3.3 B₂R-TRPV1-Ca²⁺信号轴的必要性

钙成像显示菠萝蛋白酶处理15分钟使细胞内Ca²⁺达峰值。使用B₂R拮抗剂Icatibant或TRPV1抑制剂CPZ/SB366791均可阻断Ca²⁺内流和NO生成，证实缓激肽-B₂R-TRPV1-Ca²⁺级联反应是核心信号通路。

3.4 下游AMPK-eNOS通路的激活

菠萝蛋白酶处理30分钟使AMPK和eNOS-Ser1177磷酸化达峰值。B₂R/TRPV1抑制剂或AMPK抑制剂Compound C均可阻断该效应，证明B₂R-TRPV1-Ca²⁺-AMPK-eNOS构成完整信号转导链条。

3.5 自噬流激活促进L-精氨酸合成

LC3-II/p62蛋白转换和吖啶橙染色显示，菠萝蛋白酶9小时诱导最强自噬活性。使用氯喹或巴佛洛霉素A1抑制自噬后，NO生成减少50%以上，提示自噬通过尿素循环增加L-精氨酸供给，与eNOS激活形成"双引擎"驱动NO合成。

3.7 体内血管新生验证

小鼠Matrigel实验显示，2 μg/mL菠萝蛋白酶诱导的血管新生可被B₂R拮抗剂、TRPV1抑制剂、AMPK抑制剂或自噬抑制剂完全阻断，证实体外机制在体内同样适用。

该研究首次揭示菠萝蛋白酶通过三重机制改善血管功能：1)作为激肽原酶释放缓激肽；2)激活B₂R-TRPV1-Ca²⁺-AMPK-eNOS信号轴；3)通过AMPK-自噬-尿素循环通路增加L-精氨酸储备。这种"酶-受体-代谢"的多层次调控网络，为开发针对心血管疾病和糖尿病伤口愈合的联合治疗策略提供了新思路。特别值得注意的是，菠萝蛋白酶通过激活内源性激肽系统发挥作用，避免了外源性给药可能引发的血压波动等副作用，具有显著的转化医学价值。未来研究可进一步探索其在糖尿病血管并发症等疾病中的精准应用。