一种利用Limulus polyphemus因子Gα片段进行β-1,3-葡聚糖定量检测的可靠方法

《Carbohydrate Polymers》：A robust method for quantitative detection of β-1,3-glucan using Limulus polyphemus factor Gα fragment

β-1,3-葡聚糖检测方法研究：通过表达LFGα片段并评估其与不同分支结构的β-1,3-葡聚糖的亲和力，发现Q+D1+D2片段具有最佳且分支不敏感的结合特性，据此开发出高效定量检测方法。

　　

摘要

β-1,3-葡聚糖是大多数真菌和植物细胞壁中的重要糖类成分。准确检测β-1,3-葡聚糖对于其在食品和制药行业的应用至关重要。本文我们开发了一种利用Limulus polyphemus因子Gα（LFGα）片段来检测β-1,3-葡聚糖的可靠方法。从多种可食用蘑菇中提取了具有不同分支程度的五种β-1,3-葡聚糖，并对其进行了结构表征。通过ELISA测定法评估了它们与截短LFGα变体（Q + D1 + D2、D1 + D2、D1、D2）的结合亲和力。结果表明，无论分支程度如何，LFGα片段Q + D1 + D2对所有β-1,3-葡聚糖的亲和力最高，而D1 + D2、D1和D2片段的亲和力随分支程度的增加而降低。AlphaFold预测的模型和分子对接结果也支持了这一发现。由于Q + D1 + D2对分支不敏感，因此我们可以利用基于该片段的ELISA测定法准确量化β-1,3-葡聚糖的含量。使用商业曲德拉兰（curdlan）建立了标准曲线，对五种蘑菇中β-1,3-葡聚糖的定量检测结果与其实际含量相符。我们的研究证明，基于Q + D1 + D2的ELISA测定法可以作为一种有效的β-1,3-葡聚糖定量检测方法。

引言

β-1,3-葡聚糖具有β-1,3键连接的葡萄糖主链，通常还包含β-1,6键连接的分支葡萄糖。这种多糖具有多种生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖和调节肠道微生物群的作用（Bu等人，2024；Jentho等人，2021；Li等人，2024；Ma等人，2021；Rubin-Bejerano等人，2007）。由于β-1,3-葡聚糖在食品和制药行业的广泛应用，其纯度和浓度决定了产品的功效和功能。为了更好地生产β-1,3-葡聚糖并对其进行质量控制，建立一种快速有效的定量检测方法是非常必要的。

传统的糖类结构分析方法，如甲基化分析和核磁共振，可以准确判断某种糖类是否为β-1,3-葡聚糖（Bikmurzin等人，2023）。然而，这些分析方法操作繁琐且仪器检测成本较高，不利于快速分析。尽管有一些更快速的检测方法，如苯胺蓝荧光显色法、刚果红显色法、酶法以及基于抗体和Limulus变形虫裂解物（LAL）的检测法（Giron等人，2022；Huang等人，2022；Perrine-Walker & Payne，2021；Silva等人，2021；Sunamura等人，2020；Wang等人，2016），但这些方法也存在缺点。例如，苯胺蓝方法快速、简单且成本低（Perrine-Walker & Payne，2021），但其对β-1,3-葡聚糖的定量受其整体结构的影响。刚果红染色法简单有效（Luo等人，2017；Silva等人，2021），但它依赖于β-1,3-葡聚糖具有三螺旋结构，可能导致结果不准确。酶法使用特定酶将糖类降解为单糖和寡糖以进行后续检测，但这种方法成本较高且操作复杂。抗体法基于酶联免疫吸附测定（ELISA），但其应用受到单克隆抗体制备的阻碍，且常常缺乏特异性（Sunamura等人，2020）。

基于LAL的检测法是一种具有较好灵敏度和特异性的β-1,3-葡聚糖检测方法。Morita等人发现Limulus polyphemus血液中存在一种成分——因子G（LFG），该成分对羧甲基凝胶多糖敏感并能激活凝血途径（Seki等人，1994）。从结构上看，LFG由α（LFGα）和β（LFGβ）亚基组成，其中LFGα通过其独特的串联β-葡聚糖结合域（D1和D2）来检测β-1,3-葡聚糖（Muta等人，1996；Seki等人，1994）。LFGα与β-1,3-葡聚糖结合后会发生自催化激活，引发丝氨酸蛋白酶级联反应，导致血淋巴凝固和病原体捕获（Muta & Iwanaga，1996；Obayashi等人，1995）。传统的LAL试剂用于内毒素和葡聚糖检测，通常来源于野生Limulus polyphemus的血淋巴（Yamamoto等人，2023）。一些研究探索了使用LFGα或其亚基检测人血清中的β-1,3-葡聚糖（Cui等人，2021）。然而，过度捕捞和栖息地丧失严重减少了鲎的数量，威胁到了LAL生产的可持续性及其在检测中的应用。尽管重组表达LFG有潜力替代天然材料，但在表达全长LFGα方面存在困难，同时对LFGα中特定域的功能了解不足，这也阻碍了可靠重组LAL试剂的开发。

在本研究中，我们假设可以利用LFGα片段的结合特性来开发一种有效的β-1,3-葡聚糖检测方法。为此，我们在E. coli中重组表达了LFGα及其特定片段，并利用AlphaFold预测模型、分子对接和ELISA研究了LFGα片段与不同分支程度β-1,3-葡聚糖之间的结合情况。我们发现，LFGα片段Q + D1 + D2对β-1,3-葡聚糖的结合亲和力很高，无论其分支程度如何。基于这一发现，我们建立了一种基于Q + D1 + D2的ELISA测定法来准确检测β-1,3-葡聚糖。这种新方法为β-1,3-葡聚糖的定量分析提供了有效的工具，从而促进了其在食品和制药行业的应用。

材料

曲德拉兰（线性β-1,3-葡聚糖）和右旋糖酐（α-1,6-葡聚糖）从Rhawn购买。来自laminaria digitata的 laminaran（分支β-1,3-葡聚糖）从Sigma-Aldrich购买。大麦葡聚糖（β-1,3/1,4-葡聚糖）从Megazyme购买。淀粉（α-1,4-葡聚糖）从天津华东试剂公司购买。纤维素（β-1,4-葡聚糖）从Macklin购买。β-1,6-葡聚糖根据之前的报道（Qu等人，2021）从Cantharellus cibarius制备。抗His标签抗体（2365）

从可食用蘑菇中制备β-1,3-葡聚糖

我们从可食用蘑菇Cantharellus cibarius、Agrocybe aegerita、Pleurotus eryngii、Ganoderma lucidum和Lentinula edodes中提取了五种β-1,3-葡聚糖。所有样品的总糖含量均超过90%，蛋白质和灰分含量较低（表1）。单糖组成分析显示这些多糖中的葡萄糖含量超过90%（表1）。HPGPC分析表明这些葡聚糖的分子量在4000至5000 kDa之间（图1）。

讨论

为了评估全长LFGα及其截短片段与β-1,3-葡聚糖的结合情况，我们在E. coli中表达了这些蛋白质。尽管对载体（如pET-30a、pET-17b和pET-28a）和诱导条件（温度、时间和IPTG浓度）进行了广泛优化，但全长LFGα在该原核系统中仍未表达（数据未显示）。这一限制与先前的研究结果一致，即全长LFGα仅在真核系统中成功表达。

结论

在本研究中，我们制备了四种LFGα截短片段，并确定了它们对不同β-1,3-葡聚糖的结合亲和力。Q + D1 + D2片段对β-1,3-葡聚糖的亲和力较高，而D1 + D2、D1和D2片段的亲和力随分支程度的增加而降低。基于这些发现，我们选择了Q + D1 + D2片段作为检测β-1,3-葡聚糖的最佳选择。因此，我们开发了一种基于Q + D1 + D2的ELISA测定法。

CRediT作者贡献声明

Andong Zhou：撰写——初稿、研究、概念构思。Yitong Li：方法学、研究。Yuanning Wang：可视化、研究。Yibing Wang：可视化、研究。Zhonghui Qiao：数据整理。Kevin H. Mayo：撰写——审稿与编辑、研究。Zihan Zhao：撰写——审稿与编辑、项目管理、概念构思。Lin Sun：撰写——审稿与编辑、项目管理、概念构思。

利益冲突声明

所有作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了吉林省科学技术基金（编号：20240101254JC）和国家自然科学基金（编号：32271339和32401064）的支持。