从氮代谢的角度评估盐碱土壤的最佳土地利用模式

《Environmental Technology & Innovation》：Evaluating the optimal land use pattern for saline-sodic soils from the perspective of nitrogen metabolism

农业用地系统（稻田、旱地、转地）通过降低土壤盐碱化指标（pH、EC、ESP、SAR）并提高有机质（SOM）、有效磷（AP）、有效钾（AK）含量，显著改善盐碱土壤中氮循环过程。微生物群落分析显示，农业用地系统富集氮代谢功能基因（如nifH、amoA、norB、nrfA、hao），促进氮固定（PF）、硝化（DL）和反硝化（PF）作用，其中铵态氮（NH4+-N）和亚硝酸盐氮（NO2?-N）是调控氮代谢动态的关键因子。

　　土壤氮素储存的增强是全球关注的问题，特别是在受到盐碱化影响的土壤中。土地利用方式对土壤氮素循环及其代谢过程具有显著影响，但其对盐碱土壤中氮素可利用性和微生物氮素转化的具体影响仍不明确。为解决这一知识空白，研究人员收集了六种土地利用类型——稻田（PF）、旱地（DL）、从稻田转为旱地（SGH）、林地（FL）、草地（GL）和荒地（WL）的土壤样本，以探讨氮素转化的潜在机制。与荒地相比，农业土地利用系统（PF、DL、SGH）显著降低了土壤pH值（从10.65单位降至8.38单位）、电导率（EC，从1.51 dS m?1降至0.19 dS m?1）、交换性钠百分比（ESP，从86%降至8%）以及钠吸附比（SAR，从203降至13），同时显著提高了土壤有机质（SOM）、有效磷（AP）、有效钾（AK）和氮素含量，并富集了参与氮素代谢的微生物群落。此外，农业土地利用系统在改善土壤氮素可利用性方面优于非农业系统，主要通过影响固氮、硝化作用以及反硝化作用中的硝酸盐还原为铵（DNRA）等过程。网络分析进一步揭示了土壤理化性质在塑造氮素代谢微生物群落中的关键作用。关键发现是，铵态氮（NH??-N）和亚硝态氮（NO??-N）是影响土壤氮素代谢动态的关键因素。因此，农业土地利用系统，尤其是稻田和旱地，有助于改善盐碱化土壤的盐分状况，并促进氮素代谢和储存。

氮素是生命的基本营养元素，是生态系统中植物生长和发育不可或缺的物质基础。土壤氮素循环作为全球生物地球化学循环的重要组成部分，负责将大气中惰性的氮气转化为植物可利用的形式，这一过程主要由多样化的微生物群落所介导。氮素循环包括固氮、有机氮矿化（氨化）、硝化作用、反硝化作用以及硝酸盐的同化和异化还原（ANRA和DNRA）等关键过程，这些过程由特定的功能微生物群落（如氨氧化古菌/细菌、亚硝酸盐还原菌等）所主导。这些微生物群落的结构和功能构成了调节土壤中分解、矿化以及氮素流动速率的核心动力学。因此，解析控制土壤氮素转化的机制对于提高陆地生态系统中氮素的保留和利用效率至关重要。

近年来，由于气候变化和人类活动的影响，全球范围内土地退化问题日益严重，尤其是土壤盐碱化现象。盐碱化土壤广泛分布于世界各地，如中亚、中东、南美洲、北非和太平洋沿岸等地区。据估计，全球超过100个国家的9.5亿公顷土壤受到盐碱化影响，这对全球粮食安全构成威胁，限制了农业生产，并危及土壤健康。在中国，盐碱化问题尤为突出，特别是在东北地区，其影响范围广泛且仍在持续扩大。盐碱化导致土壤pH值升高、土壤养分失衡、水分供应减少以及微生物多样性变化，这些因素进一步影响植物健康，通过渗透胁迫、离子毒性以及低养分生物可利用性等途径。

盐碱化对土壤氮素含量和转化过程也产生了不可忽视的影响。过量的可溶性盐分增加了土壤的渗透压，导致细胞内部出现有毒离子，从而破坏土壤结构，增加氮素损失，并抑制植物对水分和氮素的吸收。盐碱化还改变了氮素转化过程，如土壤氮素矿化、硝化作用、反硝化作用以及DNRA等。微生物介导的氮素循环过程不仅驱动氮素化合物（如N?O、NH??-N和NO??-N）的形成，还通过改变土壤微生物群落及其生化活动直接影响氮素转化和氮素损失。因此，寻找合理的方法以减少氮素损失、提高氮素利用效率和土地生产力，对于改善盐碱土壤质量、促进植物生长、提高农业产量以及改善生态环境具有重要意义。

土地利用是人类与自然资源互动的主要表现形式，对区域生态、土壤保护和生物地球化学循环具有深远影响。土地利用变化（如森林、草地、农田和湿地之间的转换）会引起植被覆盖、土壤理化性质以及微生物群落结构和功能的显著变化。这些变化不可避免地会连锁影响核心生态系统过程，包括土壤氮素循环。合理的土地管理措施可以增强土壤固氮能力，减少氮素损失，提高土壤质量，并有助于缓解气候变化。例如，水稻种植已被证明比自然森林或香蕉种植更能促进土壤固氮过程，而优化的管理措施可以显著提高全球农田的氮素回收效率。土地利用引起的土壤氮素转化特性差异可能由以下因素导致：（a）氧气的可利用性，影响硝化作用与反硝化作用的平衡；（b）土壤碳氮比，驱动微生物对氮素的固持和矿化；以及（c）微生物群落的协同效应。尽管智慧的土地管理可以提高非盐碱土壤中氮素的保留和利用效率，但在盐碱环境中，由于高pH值、离子毒性及渗透胁迫等因素，微生物功能和养分循环受到严重干扰，其作用机制尚未被充分研究。因此，如何通过土地利用方式重新配置土壤生物与非生物相互作用以调控氮素转化路径，成为亟需解决的关键问题。理解这些差异对于优化土地管理，以改善退化土壤中的氮素循环具有重要意义。

中国东北部松嫩平原的西部地区是世界上盐碱化土壤最大的集中区域之一，面积可达373万公顷。该地区是研究上述知识缺口的理想模型系统。近年来，该区域经历了快速而显著的土地利用变化，主要由农业集约化和开发所驱动，表现为从草地（GL）、湿地（WL）和未利用土地向农田（如PF、DL、SGH）和林地（FL）的转化。这种高强度的土地利用转换与持续的盐碱化压力相结合，构成了一个迫切需要实验研究的环境背景。因此，本研究对松嫩平原的六种盐碱化土地利用类型土壤（PF、DL、SGH、FL、GL和WL）进行了分析，包括土壤盐分和养分的变化，以及不同土地利用类型中土壤氮素转化的生物和非生物机制。我们的具体目标包括：（a）量化土地利用对土壤盐分、养分和氮素分布的影响；（b）确定不同土地利用方式对氮素循环关键微生物群落及其氮素代谢过程的影响；（c）解析驱动土壤氮素转化过程变化的主要机制，通过区分微生物群落属性与土壤理化性质的相对贡献。我们假设，在特定土地利用方式下，农业实践可以缓解盐碱化压力，重构微生物群落，以促进氮素保存微生物的生长，从而提高盐碱土壤中氮素的保留能力。

研究区域位于吉林省松原市的强嘎尔蒙古族自治县（44o17'-45o28'N，123o35'-125o18'E），地处吉林省西北部和松嫩平原的南部。该地区具有温带大陆性季风气候，四季分明，年均气温为4.5°C，年均降水量为400-500毫米，年均蒸发量超过1200毫米，无霜期为130-140天。该地区的土壤类型主要包括黑钙土、草甸土、盐土和风沙土。该区域的地形为河流冲积平原，地势低平，海拔约为150米。

本研究共设立了六种土地管理措施，包括稻田（PF）、旱地（DL）、荒地（WL）、草地（GL）、林地（FL）以及从稻田转为旱地（SGH）。其中PF、DL和SGH被定义为农业土地利用系统，而FL、GL和WL则为非农业土地利用系统。在本研究中，荒地的土壤表面为退化的草地，覆盖度较低；草地的土壤表面被碱蓬或羊草植被覆盖；林地的土壤表面则被杨树植被覆盖；旱地种植的是玉米；稻田种植的是水稻。FL、GL和WL系统由于缺乏人为的外部物质输入和农业管理措施（包括施肥和耕作），因此其养分状况相对较低。自2019年起，荒地被改造为林地和草地，经过五年的土地利用变化，这些区域的土壤性质已发生显著改变。DL和PF均遵循年度种植模式，已连续单一种植五年。SGH则是在种植水稻三年后转为种植玉米，玉米种植已持续五年。荒地的管理包括在早春开始的翻耕、灌溉和播种，以及在五月至十月期间进行水位调控、除草和施肥。PF、DL和SGH使用的氮肥主要为复合肥料和硫酸铵，年施用量为60-80千克/公顷（N-P?O?-K?O=12:8:7）。作物在每年的十月收获，部分或全部的作物残留物被粉碎并返回田间，随后在次年春季翻耕时被混入土壤耕作层（0-30厘米）。所有田块均采用100%的秸秆还田和施肥管理。

在2023年4月28日，采集了0-20厘米和20-40厘米两个土壤层的样本，以在春季耕作前（对于农田）和早期植被生长期间（对于所有土地利用类型）捕捉基础氮素转化条件，减少近期干扰。每种土地利用类型设三个样地，每个样地在五个随机位置采集土壤样本，使用直径为5厘米的钻头，混合成复合样本后运输至实验室，并在低于0°C的条件下保存。为了进行土壤理化性质分析，土壤样本在实验室中自然风干以去除如碎屑和植物根系等残留物。由于大部分微生物群落存在于0-20厘米的土壤层中，因此该层的样本用于微生物分子测试，并在-80°C下保存。

对土壤理化性质的分析包括土壤pH值和电导率（EC）的测定，采用1:5（土壤质量/水体积）的比例进行测量（Luo et al., 2018b）。土壤阳离子交换容量（CEC）采用醋酸钠法测定，并使用火焰光度计（AP1200，Aopu公司，上海）进行测量。土壤交换性钠百分比（ESP）采用火焰原子吸收光谱法测定（Feng et al., 2019）。土壤钠吸附比（SAR）采用公式法计算（Murtaza et al., 2006）。土壤水溶性K?、Na?、Ca2?和Mg2?离子首先用去离子水提取，然后通过电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）进行测定（Yayintas et al., 2007）。土壤水溶性CO?2?和HCO??则通过去离子水淋洗后采用双指示剂中和滴定法进行测定。土壤有机质（SOM）采用重铬酸钾外加热法测定（Zhu et al., 2020）。土壤总碳（TC）和总氮（TN）采用Vario Max CNS分析仪（Elementar Instrument，美国新泽西州）测定。土壤有效磷（AP）采用钼锑抗比色法测定（Rowell, 1994）。土壤有效钾（AK）采用火焰光度法测定（Rowell, 1994）。土壤铵态氮（NH??-N）和硝态氮（NO??-N）采用KCl提取并使用流动注射分析仪（SAN++; Skalar Analytical B.V., 荷兰）进行测定。土壤亚硝态氮（NO??-N）采用KCl溶液提取后，使用N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐比色法测定（成都百慧生物科技有限公司）。土壤溶解有机氮（DON）采用差减法测定（Wang et al. 2022）。土壤微生物氮（MBN）采用氯仿熏蒸提取-总有机碳（TOC）法测定（Vance et al., 1987）。

本研究采用OE生物科技公司（上海）进行宏基因组测序和生物信息学分析。从土壤样本中提取基因组DNA后，使用Mag Pure土壤DNA LQ试剂盒（Magen生物科技公司，广州）进行提取，随后通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000检测DNA浓度。文库扩增过程包括：95°C，3分钟；7-8个循环（98°C 20秒，60°C 15秒，72°C 30秒）；72°C，5分钟；4°C保持。使用fastp（v0.20.1）（Chen et al., 2018b）对读数进行修剪和过滤。使用MEGAHIT（v1.2.9）（Li et al., 2015）进行组装。使用prodigal（v2.6.3）（Hyatt et al., 2010）对组装后的contigs（长度超过500个碱基对）进行开放阅读框（ORF）预测。使用MMSeqs2（v13.45111）（Steinegger et al., 2017）构建非冗余基因集。聚类参数为95%的同源性和90%的覆盖率。每组基因集选择最长的基因作为代表序列。每个样本的清洁读数使用salmon（v1.8.0）对非冗余基因集（95%同源性）进行比对，统计相应样本中基因的丰度。基因集的代表序列（氨基酸序列）通过DIAMOND（v0.9.10.111）（Buchfink et al., 2015）使用NR、KEGG和GO数据库进行注释，e值设为1e-5。物种分类通过对应NR库的分类数据库获得。

统计分析采用SPSS 20.0（IBM公司，纽约）进行，所有数据均以均值±标准误（SE）表示。柱状图上的小写字母表示处理之间的显著差异。土壤变量的显著差异通过单因素方差分析（ANOVA）进行检验，随后进行最小显著差（LSD）分析，p < 0.05为显著水平。ANOVA和皮尔逊相关性分析均在SPSS 20.0中完成。每种土地利用类型提取五次DNA样本，每次提取进行三次PCR扩增。图3的数据反映的是生物重复（n=5）的均值。α多样性分析使用Mothur 1.30.2（密歇根州安娜堡）进行，β多样性距离计算使用Qiime 1.9.1（亚利桑那州弗拉格斯塔夫）进行。共生网络分析使用“psych”和“reshape2”包，Mantel检验相关性分析使用“vegan”包，偏最小二乘路径建模（PLS-PM）使用“plspm”包，所有分析均在RStudio 4.2.2（马萨诸塞州波士顿）中实现。

研究结果表明，与非农业土地利用系统（FL、GL、WL）相比，农业土地利用系统（PF、DL、SGH）显著降低了土壤pH值、EC、ESP和SAR（图1a、b、d、e）。具体而言，农业土地利用系统将土壤pH值从10.65单位（WL）降至8.38单位，EC从1.51 dS m?1降至0.19 dS m?1，ESP从86%降至8%，SAR从203降至13（p < 0.05）。PF的CEC值显著高于其他五个土地利用系统（图1c）。农业土地利用系统还显著降低了土壤水溶性Ca2?、Na?、K?、Mg2?、CO?2?和HCO??离子含量（图S1）。

研究结果还显示，SOM含量范围在4.0至24.0 g kg?1之间，农业土地利用系统（PF和DL）的SOM含量显著高于其他系统（图1f）。土壤TC含量在0.12-0.27 g kg?1之间，其中WL的TC含量最低，而DL和SGH的TC含量最高（p < 0.05）（图1g）。土壤AP含量在1.2-18.1 mg kg?1之间，GL的AP含量最低，PF的AP含量最高（p < 0.05）（图1h）。土壤AK含量在99.8-178.5 mg kg?1之间，在0-20厘米土壤层中，PF和DL的AK含量显著高于其他土地类型（p < 0.05）（图1i）。因此，农业系统中的SOM、AP和AK含量均高于非农业系统，而WL中的这些指标则普遍较低。

土地利用方式显著影响了盐碱土壤中的氮素形态（图2）。土壤TN含量范围在0.25-1.51 g kg?1之间，PF和DL的TN含量显著高于其他土地利用系统，而WL的TN含量最低（p < 0.05）（图2a）。土壤NH??-N含量范围在0.34至2.22 mg kg?1之间，PF的NH??-N含量显著高于其他土地利用系统，而WL的NH??-N含量最低（p < 0.05）（图2b）。土壤NO??-N含量范围在2.9至23.4 mg kg?1之间，DL的NO??-N含量最高，分别为23.4 mg kg?1和16.8 mg kg?1（p < 0.05）（图2c）。PF的NO??-N含量最高，为0.41 mg kg?1，而WL的NO??-N含量最低，为0.06 mg kg?1（p < 0.05）（图2d）。土壤MBN含量范围在15.5至137.8 mg kg?1之间，DL的MBN含量显著高于其他土地利用系统（p < 0.05）（图2e）。土壤DON含量范围在1.0至6.7 mg kg?1之间，PF、DL和FL的DON含量显著高于其他土地类型（p < 0.05）（图2f）。因此，农业土地利用系统具有更高的TN含量。特别地，稻田存储了更多的NH??-N和NO??-N，而旱地存储了更多的NO??-N、MBN和DON。

土壤氮素循环微生物群落的多样性分析如图3所示。在门水平上，参与土壤氮素循环的微生物群落主要由变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、Gemmatimonadetes和绿弯菌门（Chloroflexi）主导（图3a）。PF、DL和SGH中的变形菌门相对丰度显著高于FL、GL和WL。然而，PF和SGH中的放线菌门相对丰度显著低于其他土地类型，而PF中的酸杆菌门相对丰度也显著低于其他土地利用系统（图3a）。在属水平上，PF中的优势属为Polaromonas和Thiobacillus，SGH中的优势属为Bradyrhizobium，DL中的优势属为Pseudomonas和Flavobacterium，WL中的优势属为Streptomyces，FL中的优势属为Streptomyces、Nitriliruptor和Sphingosinicella，GL中的优势属为Pontibacter（图3b）。总体而言，PF、DL和SGH中的优势属相对丰度显著高于FL、GL和WL。观察到的物种数和群落丰富度在DL中最低，而非农业系统中的值则更高（图3c和d）。香农指数在PF中最高，表明其群落多样性最大（图3e）。

LEfSe分析用于识别不同土地利用实践下土壤氮素代谢微生物群落的生物标志物。LEfSe分析的LDA筛选阈值设为4。在系统发育树中，从内到外的圆圈代表从门到属的分类等级（图4a）。统计上显著不同的生物标志物也分布在门到属的范围内（图4b）。DL中发现的显著不同的物种数量最多，达到29个，而FL中仅有4个，农业系统中显著不同的物种数量高于非农业系统（图4b）。Gammaproteobacteria和Actinobacteria在DL中具有显著较高的相对丰度，而Betaproteobacteria在PF中，Proteobacteria和Alphaproteobacteria在SGH中，Actinobacteria在GL中，Gemmatimonadetes在WL中，Pseudonocardiaceae在FL中，这些都可以作为不同处理组的生物标志物（图4b）。因此，农业土地利用系统的微生物群落表现出更高的响应性，这可能与其在抵御盐碱胁迫和促进氮素转化功能中的作用有关。

构建了氮代谢（ko00910）功能基因集以注释氮代谢相关功能。KEGG分析显示，PF和SGH中的固氮模块相对丰度显著高于其他四种土地类型（图5a）。此外，PF中的固氮功能基因相对丰度最高（p < 0.001）（图5g）。DL中的硝化模块相对丰度最高（p < 0.05）（图5b），硝化功能基因pmoA-amoA、pmoB-amoB和pmoC-amoC的相对丰度最高（p < 0.001）（图5h）。此外，PF中土壤反硝化、DNRA和完全氨氧化模块的相对丰度最高（图5c、d、f）。PF中的反硝化功能基因（如narG、narH、norC和norB）以及DNRA功能基因（如nrfA）和完全氨氧化功能基因（如hao）的相对丰度显著高于其他土地类型（图5i、j、l）。在所有土地类型中，ANRA模块的相对丰度没有显著差异（图5e）。PF中的ANRA功能基因（如NR、nasA和nasB）的相对丰度最高（图5k）。总之，农业土地利用系统在促进土壤氮素代谢方面表现出更强的能力。

Mantel检验和PLS-PM分析表明，土壤盐碱性和养分状况对氮素转化过程具有重要影响（图7和图8）。土壤性质（如SOM和pH）被发现是影响氮素循环功能基因（如nifH、amoA、norB和nosZ）丰度的重要驱动因素（Li et al., 2024）。这一发现与我们得出的结论一致，即土壤盐碱性和养分状况驱动氮素代谢过程和功能基因的丰度（图8）。此外，土壤pH值和NO??-N/NH??-N的浓度与氮素转化过程中的微生物功能基因丰度显著相关，这与我们的发现一致，即NO??-N和NH??-N是土壤氮素代谢动态的关键决定因素（图8）（Chen et al., 2015, Zhang et al., 2018）。NH??-N是硝化作用的主要底物，其可利用性直接限制硝化作用的速率，而NO??-N作为硝化作用和反硝化作用中的关键中间产物，调节反硝化效率和氮素损失途径（如N?O排放）。相比之下，NO??-N更为稳定，但其生物化学约束较少，因此NH??-N和NO??-N更接近于调控微生物活性和氮素流动的调节因子（Zhang et al., 2018）。然而，由于土壤性质的变化影响了反硝化作用，未来的研究应关注这一过程中的氮素损失。我们的研究结果表明，农业土地利用系统，尤其是稻田和旱地系统，在增加土壤氮素含量和促进微生物介导的氮素转化过程中发挥了重要作用。这是因为管理措施（如耕作和施肥）可以直接和间接地影响土壤养分转化。因此，研发新型高效的肥料对于提高氮素利用效率、确保盐碱化农田的可持续管理至关重要。

综上所述，农业土地利用系统（PF、DL和SGH）显著降低了土壤pH值、EC、ESP、SAR以及水溶性盐离子的含量，同时显著提高了SOM、AP和AK的含量，相较于非农业土地利用系统（FL、GL和WL）。此外，农业管理措施，特别是稻田和旱地系统，显著增强了微生物群落的多样性并富集了与氮素代谢相关的微生物，从而促进了土壤氮素基因的丰富度和氮素转化过程（如固氮、硝化作用和DNRA）。土壤ESP、CO?2?、NO??-N、NO??-N和MBN是影响土壤氮素代谢微生物群落的重要因素。更重要的是，NH??-N和NO??-N是调控土壤氮素代谢动态的关键因素。在松嫩平原的盐碱土壤中，与未利用土地相比，选择耐盐作物并结合优化的肥料管理（特别是有机改良剂或平衡的NPK施肥以提高养分）以及改进的水分管理（如控制灌溉或排水以淋洗盐分）是改善土壤盐碱化、促进氮素循环和提高氮素利用效率的有效措施。稻田和旱地系统在增强微生物介导的氮素过程方面尤为显著。未来的研究应聚焦于盐碱土壤的可持续管理方法以及新型高效肥料的开发，以减少土壤盐碱化、增加土壤氮素储存并提高土壤氮素利用效率。