昼夜节律紊乱通过干扰Leydig细胞成熟和睾酮合成损害雄性大鼠生殖发育

本研究针对青少年普遍存在的昼夜节律紊乱现象，通过建立大鼠223光照模型（2天持续光照/2天持续黑暗/3天14:10光暗循环），首次系统揭示了青春期昼夜节律失调通过破坏Leydig细胞时钟基因表达、线粒体功能和类固醇合成通路，导致睾酮水平下降和精子发生障碍的分子机制。研究发现昼夜节律紊乱会降低核心时钟基因（Bmal1、Per1/2、Cry1/2）表达，使类固醇合成关键基因（Star、Cyp11a1、Hsd3b1/2）的昼夜表达相位偏移，同时抑制线粒体生物发生（Nrf1、Cytc）和动力学（Opa1、Mfn2）相关基因表达，最终导致49日龄大鼠血清睾酮水平降低和阶段VII生精小管中长形精子细胞数量显著减少。该研究为理解环境光污染对男性生殖健康的影响提供了重要实验依据。

　　

在现代社会，青少年熬夜玩手机、昼夜颠倒的生活方式已成为普遍现象。这种被称为"社交时差"的行为模式，实际上造成了人体内部生物钟与环境光照周期的严重脱节。更令人担忧的是，这种昼夜节律紊乱恰好发生在青春期——这个男性生殖系统发育的关键时期。已有研究表明，成年男性轮班工作者常出现生育力下降等问题，但昼夜节律失调如何影响青春期生殖发育的分子机制仍不清楚。这正是诺维萨德大学（University of Novi Sad）生物学与生态学系Dijana Z. Travicic等研究人员在《Reproductive Biology and Endocrinology》发表的最新研究要解决的核心问题。

研究人员采用Wistar大鼠作为模型，通过223光照方案（2天持续光照/2天持续黑暗/3天14:10光暗循环）模拟青少年昼夜节律紊乱。主要技术方法包括：通过跑轮系统监测自主活动节律；采用胶原酶消化结合Percoll梯度离心分离纯化Leydig细胞（纯度>90%）；实时荧光定量PCR分析时钟基因、类固醇合成基因和线粒体功能相关基因表达；TMRE和MitoTracker检测线粒体膜电位和线粒体质量；放射免疫法测定血清雄激素和褪黑素水平；组织学分析生精小管形态。

昼夜节律紊乱改变活动模式并损害Leydig细胞发育

研究发现，223光照组大鼠表现出明显的活动节律紊乱和自主运动减少，同时血清褪黑素水平显著降低。尽管体重增长正常，但49日龄大鼠血清雄激素水平明显下降。基因表达分析显示，对照组Leydig细胞成熟过程中，垂体激素基因（Cga、Lhb、Fshb）和GnRH受体（Gnrhr）表达逐渐增加，而5α-还原酶1（Srd5a1）表达下降，3α-羟类固醇脱氢酶（Akr1c14）和胰岛素样因子3（Insl3）表达上升。然而，223光照组表现出Srd5a1持续高表达和Akr1c14、Insl3表达抑制的异常模式。

昼夜节律紊乱改变Leydig细胞中类固醇合成相关基因的表达模式

PCA分析显示，对照组Leydig细胞成熟伴随着类固醇合成相关基因（Star、Cyp11a1、Hsd3b1/2）及其调控因子（Nur77、Sf1、Creb1a）的协调上调。但223光照组出现基因表达时序紊乱：49日龄时促黄体激素受体（Lhcgr）、清道夫受体B类成员1（Scarb1）、细胞色素P450 17α-羟化酶（Cyp17a1）等基因表达异常升高，而Hsd3b1/2表达受抑制。Cosinor分析进一步发现，223光照使Star、Cyp11a1等关键基因的昼夜表达峰值时间发生显著偏移。

昼夜节律紊乱降低Leydig细胞中时钟相关基因的转录

随着Leydig细胞成熟，对照组核心时钟基因（Clock、Bmal1、Per1/2、Cry1/2）和次级环路基因（Reverba/b、Rora/b）表达逐渐增加。但223光照显著抑制了这些基因在青春期大鼠中的表达上调，并使Bmal1、Per2、Cry1/2等基因的昼夜表达相位发生改变，表明昼夜节律失调干扰了Leydig细胞分子时钟的正常发育。

昼夜节律紊乱改变Leydig细胞中的线粒体过程

对照组Leydig细胞成熟伴随着线粒体膜电位（Δψm）、线粒体质量和ATP含量增加，以及线粒体生物发生（Tfam、Nrf1、Cox4i2）和动力学（Opa1、Mfn2、Drp1）相关基因表达上调。223光照虽未显著影响Δψm和线粒体质量，但使ATP水平降低，并抑制Nrf1、细胞色素c（Cytc）、Opa1和Mfn2等基因表达。值得注意的是，对照组中ATP水平与Star、Cyp11a1表达呈正相关，而223光照组中ATP与Cyp11a1转为负相关，提示能量代谢与类固醇合成的协调关系被破坏。

昼夜节律紊乱减少精子发生阶段VII的长形精子细胞数量

分子水平上，223光照使圆形精子细胞标志物Tnp1和长形精子细胞标志物Prm2的表达增长趋势消失，49日龄时Prm2表达显著降低。组织学分析证实，223光照组42和49日龄大鼠阶段VII生精小管中长形精子细胞数量明显减少，这与血清雄激素水平下降一致。

这项研究首次系统阐明了青春期昼夜节律紊乱损害男性生殖发育的分子机制。通过建立223光照动物模型，研究人员发现昼夜节律失调会破坏Leydig细胞分子时钟的发育，导致时钟基因表达异常和昼夜节律相位偏移。这种时钟紊乱进一步引起线粒体功能受损（ATP生成减少、生物发生和动力学相关基因表达下调）和类固醇合成紊乱（关键酶基因表达时序异常），最终造成睾酮合成减少和精子发生障碍。特别值得注意的是，研究揭示了青春期这一特殊发育阶段对昼夜节律紊乱的敏感性——这一时期既是生殖系统成熟的关键窗口，也是生物钟自身经历激素依赖性重塑的阶段。

该研究的发现具有重要的公共卫生意义。随着电子设备使用低龄化和学业压力增大，青少年昼夜节律紊乱现象日益普遍。这项研究为此类环境因素可能对男性生育力造成的长期影响提供了实验依据，也为开发针对性的干预措施（如光疗、褪黑素补充等）奠定了理论基础。未来研究可进一步探索特定时钟基因（如Bmal1、Cry1）在Leydig细胞中的靶向作用，以及不同时段光照干扰对生殖发育的差异影响，为青少年健康管理提供更精准的科学指导。