Bak通过插入Mcl-1-Puma/BimL二聚体形成异源三聚体的活细胞FRET成像研究

本研究通过定量活细胞FRET成像技术，揭示了Bcl-2家族蛋白Mcl-1与Bak、Puma、BimL的相互作用优先级及动态组装机制。研究人员发现Puma/BimL优先与Mcl-1形成二聚体，而Bak可插入该二聚体形成Bak-Mcl-1-Puma/BimL三聚体，为理解凋亡调控中蛋白竞争结合提供了新视角。

　　

细胞凋亡的精细调控一直是生命科学领域的核心问题，其中Bcl-2家族蛋白通过复杂的相互作用网络决定细胞命运。尽管已知抗凋亡蛋白Mcl-1能抑制促凋亡蛋白Bak的活化，但Mcl-1如何同时协调与不同促凋亡成员（如BH3-only蛋白Puma/BimL）的竞争结合，以及Bak是否参与高阶复合物组装，这些机制尚不明确。华南师范大学的研究团队在《Journal of Biotechnology》发表的研究中，创新性地采用荧光共振能量转移（FRET）技术，首次在活细胞中捕捉到Bak插入Mcl-1-Puma/BimL二聚体形成三聚体的动态过程。

研究团队运用三项关键技术：1）构建P2A自剪切多顺反子载体（Bak/BimL/Puma-P2A-CFP-Mcl-1）实现蛋白共表达；2）定量FRET成像分析结合能（EDmax）与结合距离；3）免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白复合物。

【Mcl-1 binds to Bak, BimL and Puma respectively to form hetero-oligomers】
通过CFP/YFP双标记FRET实验，证实Mcl-1与Bak、Puma、BimL均能形成二聚体，其中Mcl-1-Puma/BimL的结合亲和力显著高于Mcl-1-Bak（Pearson系数Rr>0.7）。

【Abstract核心发现】
当Bak与Mcl-1共表达时，Mcl-1与Puma/BimL的EDmax值升高50%，表明Bak通过空间位阻效应促使三者靠近；而Puma/BimL存在时，Mcl-1与Bak的FRET信号几乎消失，证明Mcl-1优先结合BH3-only蛋白。Co-IP进一步捕获到Bak-Mcl-1-Puma三聚体。

【Discussion机制阐释】
该研究提出"竞争插入"模型：在凋亡初期，Mcl-1通过"模式1"隔离Puma/BimL抑制凋亡；当Bak浓度升高时，其通过α2-α5螺旋插入Mcl-1-Puma二聚体的疏水沟槽，形成三聚体并释放Puma激活凋亡。这一发现解释了肿瘤细胞中Mcl-1过表达如何被BH3模拟物靶向破解，为开发诱导三聚体形成的抗癌药物提供了新思路。