双链测序技术与转基因啮齿类突变试验在NDMA体内诱变评估中的一致性研究

本研究通过双链测序(DS)与转基因啮齿类突变试验(TGR)的联合分析，揭示了N-亚硝基二甲胺(NDMA)在肝脏中的剂量依赖性诱变效应。研究人员利用DS技术的高灵敏度(误差率低至10-8-10-7)，首次在28天重复给药实验中确定NDMA的无观察遗传毒性效应水平(NOGEL)为0.07 mg/kg/天，并通过三核苷酸突变谱分析验证其机制。研究证实DS比传统TGR方法具有更高的精确度和更低的个体间变异，为遗传毒理学评估提供了更精准的出发点确定和3Rs(减少、优化、替代)优势。

　　

N-亚硝基化合物作为环境污染物和药物杂质，其遗传毒性风险评估一直是公共卫生和制药行业的焦点。其中N-亚硝基二甲胺(NDMA)被国际癌症研究机构(IARC)列为2A类致癌物，能通过形成O⁶-甲基鸟嘌呤加合物引发C>T突变。传统转基因啮齿类突变试验(TGR)虽被广泛采用，但依赖细菌报告基因的间接检测方法存在灵敏度不足、操作繁琐等局限。

英国阿斯利康(AstraZeneca)与TwinStrand Biosciences的研究团队创新性地将双链测序(DS)技术应用于OECD合规的Muta^TMMouse肝脏样本分析。这项发表于《Archives of Toxicology》的研究通过两种测序策略——靶向lacZ转基因的panel和覆盖小鼠基因组20个位点的Mutagenesis panel，在单次给药(5-10 mg/kg)和28天重复给药(0.02-4 mg/kg/天)模型中系统评估NDMA诱变效应。

关键技术包括：(1)基于分子条形码的DS文库构建，实现10^-8级超低误差率；(2)三核苷酸谱分析揭示突变特征；(3)基准剂量(BMD)模型比较DS与TGR的敏感性差异。研究使用雄性Muta^TMMouse肝脏样本，通过酶切片段化、双链UMI标记和杂交捕获等步骤完成测序。

剂量依赖性突变频率变化
DS在0.19 mg/kg/天剂量组首次检测到显著MF升高，确定NOGEL为0.07 mg/kg/天。Mouse Mutagenesis panel显示15.8倍MF增幅，显著高于TGR的4.8倍，表明基因组代表性区域对NDMA更敏感。

技术对比与BMD分析
DS的lacZ panel与TGR数据高度相关(r>0.95)，但个体变异降低50%。BMD₅₀模型显示两者置信区间重叠，但DS精度更高。通过效应规模理论校正后，基因组panel与TGR的BMD差异消失，证实方法学一致性。

突变特征解析
三核苷酸谱分析揭示：低剂量组呈现SBS1样自发脱氨基特征(CpG位点C>T)，而≥0.19 mg/kg/天组转为SBS11特征(N-C-嘧啶背景C>T)，与NDMA烷化机制一致。值得注意的是，lacZ转基因因细菌序列特性导致背景C>T偏高，凸显基因组代表性panel的优势。

该研究首次实现DS技术与标准TGR试验的全面桥接，证实DS能更早发现遗传毒性信号(灵敏度提升3倍)，并提供突变谱等机制信息。通过建立NOGEL和LOGEL剂量阈值，为药物杂质风险评估提供新工具。尤其对新型亚硝胺药物相关杂质(NDSRIs)的检测，DS技术可克服传统Ames试验的局限性，推动遗传毒理学进入精准定量时代。研究展示的"剂量-突变谱"关联模型，为区分阈值效应与线性反应提供了分子证据，对癌症风险评估具有范式变革意义。