基底温度/浸没介质/电镜网格材料对冷冻光学超分辨显微成像中玻璃化阈值的影响机制研究

为解决冷冻单分子定位显微技术(cryo-SMLM)中高功率激光引发样品玻璃化转变的难题，研究人员系统探究了基底温度、浸没介质和电镜网格材料对玻璃化阈值的影响。通过有限元模拟和实验验证，发现金属网格在低温氮气介质中耐受性最佳，金网格在640 nm激光下阈值显著提升。该研究为优化冷冻关联光镜电镜(cryo-CLEM)成像系统提供了定量依据。

　　

在结构生物学领域，冷冻电子显微镜(cryo-EM)已成为解析生物大分子结构的利器，而冷冻关联光镜电镜(cryo-CLEM)技术更进一步整合了荧光标记的特异性和电镜的高分辨率优势。然而，这项技术面临着一个关键瓶颈：光学显微镜的衍射极限分辨率(约450-600 nm)与电镜的纳米级分辨率之间存在两个数量级的巨大鸿沟。虽然冷冻单分子定位显微技术(cryo-SMLM)有望填补这一鸿沟，但实施过程中高功率激光照射可能导致冷冻样品发生玻璃化转变(devitrification)，破坏其近生理状态——当冰温超过138 K时，样品就会从玻璃态转变为结晶态，严重影响成像质量。

欧洲分子生物学实验室(EMBL)的研究团队在《Journal of Structural Biology》发表的研究中，通过系统的热力学模拟和实验验证，揭示了影响玻璃化阈值的关键因素。研究人员构建了包含基底温度(77 K至133 K)、浸没介质(液氮、HFE-7200等)和电镜网格材料(金、银、碳等)的多维参数空间，采用有限元方法模拟热传导过程，并在三种不同冷冻平台(开放式液氮冷却、真空液氮冷却和冷冻浸没式)上进行实验验证。

关键技术方法包括：1) 基于COMSOL Multiphysics的热传导有限元模拟，建立高斯激光束热源模型；2) 使用不同材料(金、银、碳)涂覆的TEM网格进行实验验证；3) 在三种冷冻系统(95 K开放式、77 K真空式和133 K浸没式)中测量实际玻璃化阈值；4) 以大肠杆菌(E. coli)为模型生物评估生物样品的实际耐受性。

【Results】
通过模拟标准300目电镜网格的热传导特性，研究发现：在液氮冷却的开放式系统中，碳支持膜在冷冻浸没介质(HFE-7200)中表现出更好的散热性能；而在低温氮气介质中，金属支持膜因更低的基底温度可耐受更高激光强度。特别值得注意的是，金网格在640 nm激光照射下表现出与银涂层网格相当的高阈值特性。

【Discussion】
研究证实真空冷冻系统中金属支持膜仍能保持高效散热，而超低温液氦(8 K)环境可进一步提升阈值。这些发现为不同实验条件下的激光强度设置提供了定量指导：当使用碳支持膜时推荐采用冷冻浸没介质，而金属网格更适合低温气体环境。

该研究的创新性在于首次系统量化了多种环境参数对玻璃化阈值的协同影响，解决了cryo-SMLM技术应用中"高分辨率"与"样品保护"之间的矛盾。特别是发现金网格在特定波长下的优异表现，为开发新型高性能冷冻样品载体提供了方向。这些成果将显著提升冷冻关联显微技术的成像质量和可靠性，推动结构生物学研究向更高分辨率迈进。