基于RT-LAMP技术的辣椒轻斑驳病毒快速比色检测方法开发及应用研究

本研究针对辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)检测存在的成本高、耗时长等问题，开发了靶向RNA依赖的RNA聚合酶(PMMoV_RdRp)和外壳蛋白(PMMoV_CP)的两种比色RT-LAMP检测技术。结果显示RdRp检测限达100拷贝/μL，与RT-qPCR相当，且20-30分钟即可肉眼判读，为农业病害监测、废水检测等场景提供了快速、经济的解决方案。

　　

辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）是危害茄科作物的主要病原体，可造成15-40%的产量损失，其惊人的环境稳定性使其成为全球农业的持续威胁。更令人意外的是，这种植物病毒竟成为人类粪便中含量最高的病毒之一，浓度高达10⁹拷贝/克，在废水监测中展现出作为人类粪便污染指示物的独特价值。然而传统RT-qPCR检测需要精密仪器，而免疫分析法又存在灵敏度不足的问题，这给田间快速诊断和环境监测带来巨大挑战。

美国南佛罗里达大学（University of South Florida）的研究团队在《Journal of Virological Methods》发表创新成果，开发出两种无需复杂设备的RT-LAMP比色检测体系。研究人员采用合成gBlock作为阳性对照，分别针对病毒保守的RdRp基因和CP基因设计5-6条特异性引物，通过肉眼观察羟基萘酚蓝颜色变化实现可视化检测。

关键技术包括：1）基于PrimerExplorerV5软件设计多组RT-LAMP引物；2）建立包含F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物的多级扩增体系；3）采用60°C等温扩增优化反应条件；4）通过比色法实现结果判读。研究特别选用人类粪便样本和常见茄科作物作为测试材料。

【RT-LAMP Assay Detection Limit】
PMMoV_RdRp检测体系在10分钟内即可检出10⁶-10⁹拷贝/μL的高浓度样本，20分钟达到100拷贝/μL的检测限，与RT-qPCR灵敏度相当。而CP检测体系灵敏度低一个数量级，但30分钟内仍可完成检测。

【Discussion】
相比传统方法，该技术突破性地将检测时间缩短至20-30分钟，且无需核酸提取纯化步骤。特异性测试表明，两种引物组均不与宿主植物或其他烟草花叶病毒属成员发生交叉反应。研究人员特别指出，单环引物设计有效降低了假阳性率。

这项研究的重要意义在于：首次建立针对PMMoV的双基因RT-LAMP检测体系，其便携特性使其特别适合田间即时检测。作为人类粪便污染的生物标志物，该技术还可应用于污水处理评估、娱乐用水质量监测等领域。研究者特别强调，该方法在食品安全溯源中具有潜在应用价值，为建立"从农田到餐桌"的全程监控网络提供了技术支撑。