双探针滚环扩增-侧向层析试纸条快速检测法在卡特氏藻监测中的应用研究

针对有害藻华(HABs)中卡特氏藻(Amphidinium carterae)的监测难题，研究人员开发了双探针滚环扩增-侧向层析试纸条(dpRCA-LFD)检测技术。该技术基于ITS序列设计特异性探针，在61°C连接温度、50分钟扩增条件下，可检测低至1.3拷贝/μL的质粒DNA和单细胞样本，灵敏度较传统PCR提升100倍，且无需专业设备即可实现可视化判读，为海洋环境监测提供了高效便捷的解决方案。

　　

海洋环境中日益频发的有害藻华(HABs)正对全球生态系统和人类健康构成严峻威胁。其中，能产生溶血毒素和雪卡毒素的卡特氏藻(Amphidinium carterae)在中国南海等海域的分布范围持续扩大，传统显微镜检测方法存在耗时长、易误判等缺陷，而现有分子检测技术又依赖昂贵仪器。针对这一技术瓶颈，哈尔滨工业大学（威海）的研究团队在《Marine Pollution Bulletin》发表创新成果，开发出双探针滚环扩增-侧向层析试纸条(dpRCA-LFD)检测体系。

研究采用双探针设计策略，短探针(SP,18nt)和长探针(LP,58nt)均经5'端磷酸化修饰，靶向卡特氏藻ITS序列，同时以秀丽隐杆线虫金属硫蛋白-2基因作为参比。关键技术包括：1)优化dpRCA反应体系(61°C连接温度+50分钟59°C扩增)；2)建立LFD可视化检测流程；3)通过21种微藻对比实验验证特异性；4)采用模拟水样和自然样本进行实用性评估。

【dpRCA反应系统】
温度梯度实验显示61°C时扩增效率最高(图S1A)，10次连接循环即可达到平台期。灵敏度测试表明，该方法对基因组DNA的检测下限达4.5×10^?4 ng μL^?1，较常规PCR提升两个数量级。

【特异性验证】
基于ITS序列设计的探针仅与卡特氏藻发生特异性反应，与20种对照藻株无交叉信号，包括形态近缘种(表S1)。

【灵敏度分析】
在重组质粒检测中，1.3拷贝/μL的检出限相当于单细胞水平。模拟水样实验证实，dpRCA-LFD可稳定检出人工添加的单个卡特氏藻细胞。

【自然样本检测】
对添加卡特氏藻的真实海水样本进行检测，成功识别目标藻细胞，验证了方法的现场适用性。

该研究突破性地将dpRCA与LFD技术整合，其创新价值体现在：1)首创双探针设计显著提升特异性，避免近缘种干扰；2)等温扩增特性摆脱对PCR仪的依赖；3)试纸条检测实现"肉眼可视"的结果判读。相比需显微镜检的传统方法和依赖精密仪器的qPCR技术，dpRCA-LFD兼具实验室精确性和现场检测便捷性，为建立有害藻类早期预警系统提供了关键技术支撑。研究获得山东省自然科学基金(ZR202204170002)等多项资助，相关成果已应用于我国南海海域的生态监测实践。