多因素协同适应性实验室进化策略通过重塑关键代谢通路显著提升Aurantiochytrium sp. PKU#Mn16的DHA产量

本研究针对海洋原生生物Aurantiochytrium在发酵过程中面临的环境适应性与DHA产量不足问题，创新性地采用分阶段酸性适应性实验室进化(ALE)策略，结合低pH(3.5)、低温(16°C)和高溶氧(230 rpm)三重胁迫条件。通过5阶段150天的持续驯化，获得DHA产量提升171.4%的优良菌株ALE_AC_11。转录组分析揭示该策略通过上调糖酵解和聚酮合酶(PKS)通路关键酶表达，优化ATP/NADPH供应机制，显著促进多不饱和脂肪酸合成。研究为微生物DHA工业化生产提供了创新性解决方案。

　　

在健康营养领域，二十二碳六烯酸(DHA)作为ω-3系列长链多不饱和脂肪酸，对婴幼儿脑神经发育和成人心血管健康具有重要作用。传统深海鱼油来源的DHA面临资源枯竭、重金属污染等问题，而微生物发酵法因其可持续性和可控性成为理想替代方案。然而，野生型海洋破囊壶菌(Aurantiochytrium)在工业发酵过程中面临环境适应性差、DHA产量不足等瓶颈，特别是发酵后期pH下降会显著抑制细胞生长和脂质积累。

天津大学海洋环境生态中心的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表重要研究成果。为解决上述问题，研究人员以Aurantiochytrium sp. PKU#Mn16为对象，创新性地设计了三重胁迫协同的适应性实验室进化(ALE)策略：采用柠檬酸诱导的酸性环境(pH 3.5-5.5)、低温(16°C)和高溶氧(230 rpm)条件进行长达150天的分阶段驯化。通过5L发酵罐验证，最终获得的ALE_AC_11菌株生物量、总脂肪酸(TFA)和DHA产量分别提升106.3%、243.8%和171.4%，实现了工业化生产的重要突破。

研究主要采用正交实验设计优化ALE条件，通过气相色谱分析脂肪酸组成，结合Illumina HiSeq 2500平台进行转录组测序，利用Trinity软件进行de novo组装，并通过KEGG数据库进行通路富集分析。多阶段发酵实验在5L生物反应器中进行，采用溶解氧和温度梯度控制策略。

研究结果部分：

1. 三重胁迫协同进化显著增强生物量和脂质生产力
   通过12种条件组合的正交实验发现，柠檬酸诱导的低pH(3.5)结合低温(16°C)和高溶氧(230 rpm)条件效果最优。ALE_AC_11菌株在标准培养条件下DHA产量达1.9 g/L，较野生型提高171.4%。值得注意的是，甘油激酶(GK)基因的持续上调提示甘油可能作为替代碳源进一步增产。

2. 酸性适应性进化改变脂质生物合成流向
   虽然多数ALE菌株的DHA/TFA比例下降，但柠檬酸单因素驯化菌株该比例提升22%，显示不同胁迫条件对脂肪酸组成的特异性调控。高溶氧条件虽促进脂质积累，但可能导致DHA氧化降解。

3. ALE菌株早期代谢重编程特征
   36h发酵阶段的转录组显示，糖酵解途径(如GAPDH、PK)和PKS通路(PKS A/B/C)关键酶显著上调，同时三羧酸循环(IDH、MDH)和氧化磷酸化相关基因表达增强，为脂质合成提供充足乙酰-CoA和ATP。竞争性途径(如萜类合成)的抑制进一步优化碳流向。

4. 晚期代谢适应维持能量平衡
   48h阶段，ALE菌株表现出上调和下调基因数量显著变化(4797个DEGs)，特别是RNA聚合酶相关基因下调，反映代谢活性降低。此时磷酸戊糖途径(G6PD)增强而糖酵解减弱，通过β-氧化补偿ATP供应，维持DHA持续合成。

5. 生物反应器验证工业化潜力
   5L规模多阶段发酵显示，ALE_AC_11菌株生物量达71.1 g/L，DHA产量9.4 g/L，较野生型提高22.1%。温度-溶氧梯度控制策略有效协调了细胞生长与脂质积累阶段的需求。

该研究通过创新性的多因素协同ALE策略，成功突破了传统微生物DHA生产的技术瓶颈。研究不仅揭示了低pH胁迫下硫酯酶结构域快速释放产物的分子机制，还发现了甘油代谢在碳流重分配中的潜在价值。特别重要的是，转录组证据表明PKS通路在高溶氧环境下具有比脂肪酸合酶(FAS)通路更强的NADPH利用效率和氧化应激耐受性，这为后续基因工程改造提供了明确靶点。研究成果对实现微生物DHA的规模化生产具有重要指导意义，同时为其他高价值脂质衍生化合物的代谢工程提供了范式参考。