万古霉素功能化磁珠-qPCR平台实现食品样本中单核细胞增生李斯特菌活/死细胞的快速鉴别

为解决传统检测方法耗时长、无法区分活/死菌的技术瓶颈，研究人员开发了基于万古霉素功能化磁珠（VMBs）与qPCR联用的快速检测平台。该技术通过靶向活菌细胞壁D-Ala–D-Ala motif实现选择性捕获，结合SYBR Green qPCR定量死菌DNA，12小时内完成检测，灵敏度达102 CFU/mL，在牛肉、沙拉等复杂基质中回收率超96.4%，为食品安全监测提供了高效工具。

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是冷藏食品中的"隐形杀手"，能在4℃低温下繁殖并引发致命感染。传统培养法需3-5天才能确诊，而常规PCR又无法区分死菌残留DNA导致的假阳性。更棘手的是，现行荧光染色法（如PMA-qPCR）在复杂食品基质中常出现交叉干扰，且需昂贵设备支持。这种检测困境使得即食食品的安全监控面临严峻挑战。

针对这一难题，中国的研究团队创新性地将抗生素特性与分子检测技术结合。万古霉素（Vancomycin）能特异性结合革兰氏阳性菌细胞壁上的D-Ala–D-Ala片段——这个关键靶点仅在活菌完整肽聚糖上暴露。基于此原理，研究人员开发了万古霉素功能化磁珠（VMBs）与实时定量PCR（qPCR）的联用平台。该成果发表于《Microchemical Journal》，实现了12小时内完成活/死菌鉴别，比传统方法提速3倍以上。

关键技术包括：1）通过EDC/NHS化学交联制备VMBs探针；2）优化磁吸附动力学参数；3）建立基于inlB基因的SYBR Green qPCR检测体系；4）开发活/死菌校正算法。研究选用牛肉、奶酪等典型食品基质进行验证。

【研究结果】

1. 检测原理验证：VMBs对活菌捕获效率达98.7%，死菌非特异性吸附<5%，证明D-Ala–D-Ala结合的高度选择性。
2. 性能参数：线性范围10¹–10⁷ CFU/mL，最低检测限（LOD）为10² CFU/mL，RSD<3.6%显示优异重复性。
3. 基质适应性：在含高脂肪（三文鱼）、高蛋白（奶酪）等复杂样本中，回收率稳定在96.4–99.2%。
4. 稳定性测试：死菌DNA在4℃保存7天后仍可有效扩增，满足实际检测时效需求。

该研究的突破性在于：首次将抗生素靶向作用转化为活菌分离工具，通过物理移除活菌而非染料抑制的策略，从根本上规避了PCR假阳性问题。相较于需要光活化处理的PMA-qPCR，VMBs-qPCR操作更简便，且不受食品基质淬灭效应影响。值得注意的是，研究中建立的预校准算法能自动校正不同食品对磁珠捕获效率的微小差异，这是实现高准确度的核心创新点。

从应用角度看，这项技术将食品安全监测从"天"级提速至"小时"级，特别适合即食食品的出厂快速筛查。未来若与便携式qPCR设备结合，有望发展成现场检测方案。此外，该平台对临床标本中耐药菌存活状态的评估同样具有潜在价值，为感染治疗提供更精准的病原学依据。